第二章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第1頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)物（culture）：在微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物（pureculture）：只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物。

純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，是微生物學(xué)的基本技術(shù)之一。顯微技術(shù)是進(jìn)行微生物研究的另一項(xiàng)重要技術(shù)。正是由于顯微技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)的建立，才使我們得以認(rèn)識(shí)豐富多彩的微生物世界，對(duì)其真正研究，使其發(fā)展為一門(mén)學(xué)科。第2頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)第三節(jié)顯微鏡下的微生物第3頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無(wú)菌技術(shù)（aseptictechnique）

1、概念：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作環(huán)境的技術(shù)。

2、方法：器具、培養(yǎng)基及其滅菌接種操作——無(wú)菌操作第4頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第5頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月固體培養(yǎng)基是用瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基。

細(xì)菌的固體培養(yǎng)特征：

菌落（colony）：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體，稱為菌落。每個(gè)菌落一般是由單個(gè)微生物活體細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖形成的純培養(yǎng)物。二、用固體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)第7頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌落特征：有光滑型、粗糙型和粘液型三種。如濕潤(rùn)、較光滑、較透明、較粘稠、易挑起、質(zhì)地均勻、菌落正反面及邊緣與中央部分的顏色一致。生物學(xué)意義：不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落（或菌苔）一般都具有穩(wěn)定的特征，是微生物分類鑒定的指征之一。

菌苔（lawn）：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔（lawn）。第8頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌落第9頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

目前實(shí)驗(yàn)室常用固體培養(yǎng)基獲得微生物純培養(yǎng)物的幾種方法：1、涂布平板法（spreadplatemethod)2、稀釋倒平板法(pourplatemethod，50℃左右)3、平板劃線法(streakplatemethod)（如四區(qū)劃線）4、稀釋搖管法(shaketubemethod)第11頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月涂布平板法與稀釋倒平板法12第12頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平板劃線法第13頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月稀釋搖管法（分離厭氧菌）第14頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)---稀釋法適用于一些個(gè)體大的細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類等。通過(guò)高度稀釋，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。同一個(gè)稀釋度應(yīng)有較多的平行試管。四、單細(xì)胞（孢子）分離---顯微分離法對(duì)操作技術(shù)要求較高，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。第15頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、選擇平板培養(yǎng)根據(jù)待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)條件（對(duì)于從自然界中分離、尋找有用的微生物十分重要，如從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌，分離高溫菌，分離某種抗菌素抗性菌株）

2、富集培養(yǎng)加富性選擇培養(yǎng)基（投其所好）--對(duì)羥基苯甲酸抑制性選擇培養(yǎng)基（取其所抗）--致病性腸道桿菌五、選擇培養(yǎng)第16頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第17頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、微生物的保藏技術(shù)菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。

保藏的方法：傳代培養(yǎng)保藏4℃

冷凍保藏-196℃，-70℃，-30～-20℃

干燥保藏法沙土管，安瓿管（冷凍真空干燥保藏，最普遍最重要）第18頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)

絕大多數(shù)微生物的大小都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肉眼的觀察極限，因此一般必須借助顯微鏡放大系統(tǒng)的作用，才能看到它們的個(gè)體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。除了放大外，決定顯微觀察效果的還有兩個(gè)重要因素，分辨率和反差。分辨率是指能辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力，而反差是指樣品區(qū)別于背景的程度，它們與顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)，也取決于進(jìn)行顯微觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的正確使用以及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)。第19頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代顯微技術(shù)不僅僅是觀察物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，而且發(fā)展到對(duì)物體的組成成分的定性和定量，特別是與計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合出現(xiàn)的圖像分析、模擬仿真等技術(shù)，為探索微生物的奧秘提供了強(qiáng)大武器。第20頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、顯微鏡的種類及原理

1、普通光學(xué)顯微鏡第21頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第22頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、暗視野顯微鏡第23頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、相差顯微鏡4、熒光顯微鏡（激光共聚焦顯微鏡）第24頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、透射電子顯微鏡第25頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6、掃描電子顯微鏡

7、掃描隧道顯微鏡第26頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、顯微觀察樣品的制備

1、光學(xué)顯微鏡的制樣（1）活體觀察：壓滴法懸滴法菌絲埋片法（玻璃紙，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養(yǎng)，鏡下）第27頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）染色觀察死菌細(xì)菌染色法正染色簡(jiǎn)單染色法鑒別染色法抗酸染色法革蘭染色法芽孢染色法姬姆薩染色法負(fù)染色：莢膜染色法等活菌：用美藍(lán)或TTC（氧化三苯基四氮唑）等做活菌染色第28頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第29頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月革蘭染色法（GramStain)第30頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、電子顯微鏡的制樣

（1）透射電鏡的樣品制備

1）負(fù)染技術(shù)

2）投影技術(shù)

3)超薄切片技術(shù)：取材→固定→脫水→浸透與包埋→切片→撈片→染色→觀察第31頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第32頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）掃描電鏡的樣品制備

利用電子束作光柵狀掃描以取樣品的形貌信息。主要要求樣品干燥，且表面能夠?qū)щ?。干燥方法：自然干燥真空干燥冷凍干燥臨界點(diǎn)干燥等第33頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)顯微鏡下的微生物微生物：細(xì)胞型：凡具有細(xì)胞形態(tài)的微生物非細(xì)胞型：細(xì)胞型微生物：細(xì)菌（Bacteria)

古生菌（Archaea）真核生物（Eukarya）第34頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定義：以二分裂為主要繁殖方式的單細(xì)胞原核微生物。

1、細(xì)菌的形態(tài)和排列三種基本形態(tài)：球狀：一個(gè)分裂面、兩個(gè)分裂面、三個(gè)分裂面、無(wú)定向分裂面

桿狀：?jiǎn)螚U、鏈桿、柵狀、八字

螺旋狀：弧菌、螺旋菌一、細(xì)菌第35頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第36頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單球菌細(xì)胞分裂沿一個(gè)平面進(jìn)行，新個(gè)體分散而單獨(dú)存在。如尿素微球菌第37頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雙球菌細(xì)胞沿一個(gè)平面分裂，新個(gè)體成對(duì)排列。如肺炎鏈球菌第38頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四聯(lián)球菌細(xì)胞分裂是沿兩個(gè)相垂直的平面進(jìn)行，分裂后每四個(gè)細(xì)胞特征性地連在一起，成田字形。如四聯(lián)微球菌第39頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月鏈球菌細(xì)胞沿一個(gè)平面進(jìn)行分裂，新個(gè)體不但可保持成對(duì)的樣子，并可連成鏈狀。如乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、溶血性鏈球菌第40頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月八疊球菌細(xì)胞按三個(gè)互相垂直的平面進(jìn)行分裂后，每八個(gè)球菌特征性地連在一起形成立方體形。如藤黃八疊球菌第41頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月葡萄球菌細(xì)胞無(wú)定向分裂，多個(gè)新個(gè)體形成一個(gè)不規(guī)則的群體，猶如一串葡萄。如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌第42頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月桿菌桿菌的基本形態(tài)短桿狀、長(zhǎng)桿狀、棒桿狀、梭狀桿狀、月亮狀、竹節(jié)狀、分枝狀等；按桿菌細(xì)胞繁殖后的排列方式則有鏈狀、柵狀、“八”字狀等桿菌細(xì)胞的排列方式鏈狀、柵狀、八字狀、鞘衣包裹的絲狀等第43頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月短桿狀長(zhǎng)桿狀梭狀芽孢菌第44頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月螺旋菌根據(jù)螺旋環(huán)的數(shù)目將螺旋狀細(xì)菌分為：弧菌：螺菌：2~6環(huán)的小型堅(jiān)硬的螺旋狀細(xì)菌，有鞭毛，靠鞭毛運(yùn)動(dòng)。螺旋體：高于6環(huán)，體長(zhǎng)而柔軟的螺旋狀細(xì)菌，無(wú)鞭毛，靠周質(zhì)間軸絲伸縮運(yùn)動(dòng)。第45頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第46頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他形態(tài)：柄細(xì)菌球衣菌支原體星型細(xì)菌細(xì)菌的菌落特征：表面濕潤(rùn)，小而突起或大而平坦、易挑起第47頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月柄細(xì)菌球衣菌支原體星型細(xì)菌第48頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第49頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第50頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第51頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌的形態(tài)受溫度、pH、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時(shí)間等因素影響很大。一般是細(xì)菌在適宜的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)8~18h時(shí)形態(tài)比較典型，在不利環(huán)境或菌齡老時(shí)常出現(xiàn)梨形、氣球狀和絲狀等不規(guī)則的多形性（polymorphism），稱為衰退型（involutionform）。因此，觀察細(xì)菌的大小和形態(tài)，應(yīng)選擇其適宜生長(zhǎng)條件下的對(duì)數(shù)期為宜。第52頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、古生菌與細(xì)菌類似的個(gè)體形態(tài)，但多生活于一些生存條件十分惡劣的極端環(huán)境中，如高鹽、高溫、高酸等。如“121株”能在121℃的條件下繁殖。第53頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第54頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、原核生物的細(xì)胞大小細(xì)菌大小量度單位：微米（μm）亞細(xì)胞構(gòu)造的量度單位：納米（nm）常見(jiàn)細(xì)菌的大?。呵蚓褐睆?.5~1.0μm桿菌：寬×長(zhǎng)0.5~1.0×1.0~5.0μm螺形菌：寬×長(zhǎng)0.5~1.0×1.0~50μm第55頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第56頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月最小和最大的細(xì)菌

最小的細(xì)菌：納米細(xì)菌，細(xì)胞直徑最小為50nm，甚至比最大的病毒更小一點(diǎn)。最大的細(xì)菌：一種硫磺細(xì)菌，其大小一般在0.1~0.3mm，但有些可達(dá)0.75mm，相當(dāng)于果蠅頭部的大小，能夠清楚地用肉眼看到。命名為T(mén)hiomargaritanamibiensis，即“納米比亞硫磺珍珠菌”。第57頁(yè)，課件共63頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖中箭頭所指的是直徑在0.5mm的一個(gè)Thiomargaritanamibiensis