第8章基因工程原理PrinciplesofGeneEngineering本章內(nèi)容1基因工程的歷史和發(fā)展2基因工程的基本內(nèi)容和技術(shù)3基因工程相關(guān)酶學(xué)4基因工程中的載體和宿主系統(tǒng)5目的基因的獲得和分離方法6外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞7重組體的鑒定和分析8外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)9外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)10蛋白質(zhì)工程11基因工程的應(yīng)用和展望

5目的基因的獲得和分離方法PrinciplesofGeneEngineering常見(jiàn)的目的基因的獲得方法5.1基因的人工化學(xué)合成5.2基因文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)，cDNA文庫(kù)5.3PCR法PrinciplesofGeneEngineering5.1基因的人工化學(xué)合成20世紀(jì)50年代，KhoranaHG就開(kāi)始了寡核苷酸的化學(xué)合成，并于1956年首次成功合成了二核苷酸。從此開(kāi)始了核酸的人工化學(xué)合成，他獲得1968年諾貝爾生理學(xué)核醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（與他人共享）。他合成了酵母丙氨酸t(yī)RNA基因，并在1979年首次合成出具有生物活性的126bp長(zhǎng)度的大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因。PrinciplesofGeneEngineering核酸化學(xué)合成的指導(dǎo)思想就是，將核苷酸所有的活性基團(tuán)都用保護(hù)劑加以封閉，只留下需要反應(yīng)的基團(tuán)，用活化劑使反應(yīng)基團(tuán)激活；用縮合劑使一核苷酸羥基與另一個(gè)核苷酸磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵，從而定向發(fā)生聚合。PrinciplesofGeneEngineeringDNA的化學(xué)合成的方法剛開(kāi)始是磷酸二酯法，后來(lái)1960年Letsinger等又發(fā)明了磷酸三酯法，后來(lái)又出現(xiàn)了亞磷酸三酯法。進(jìn)一步的發(fā)展出現(xiàn)了固相化，即將第一個(gè)核苷酸的3’-OH固定在可控孔徑玻璃微球（CPG）上，因此，沖洗十分的方便，由此出現(xiàn)了DNA自動(dòng)合成儀。目前的DNA自動(dòng)合成儀都使用亞磷酸三酯法。PrinciplesofGeneEngineering腺嘌呤、胞嘧啶堿基上的氨基用苯甲酰基（bz）保護(hù)，鳥(niǎo)嘌呤堿基上的氨基用異丁?；↖b）保護(hù)，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)。合成的每個(gè)循環(huán)周期分為4個(gè)步驟：脫去保護(hù)基、偶聯(lián)反應(yīng)、封端反應(yīng)和氧化反應(yīng)。PrinciplesofGeneEngineering第一步：脫去保護(hù)基:用酸處理，使核苷酸5‘-OH上面的保護(hù)基DMT脫落。第二步：偶聯(lián)反應(yīng)：使用二異丙基氨基亞磷酰氯甲酯作為活化劑和縮合劑，在弱堿化合物四唑催化下，了、偶聯(lián)形成亞磷酸三酯。第三步：封端反應(yīng)：加入乙酸酐使沒(méi)有參與偶聯(lián)反應(yīng)的5’-OH被乙?；?，以免參與反應(yīng)，出現(xiàn)錯(cuò)誤序列。第四步：氧化作用：合成亞磷酸三酯后用碘氧化，形成較為穩(wěn)定的磷酸三酯。PrinciplesofGeneEngineering按照事先設(shè)計(jì)好的順序逐個(gè)加入核苷酸，合成結(jié)束后，使用硫酚核三乙胺脫掉保護(hù)基，并用氨水水解合成的寡核苷酸，再用HPLC和凝膠電泳純化鑒定。每個(gè)核苷酸的合成循環(huán)需要7-10分鐘，50個(gè)核苷酸的DNA片段需要6-8小時(shí)，十分迅速方便。PrinciplesofGeneEngineering人工合成基因的基本程序a利用化學(xué)方法合成基因DNA不同部位的兩條鏈的寡聚核苷酸的短片段，再退火成為兩端活性末端的DNA雙鏈片段；b將上述的DNA片段按照正確順序進(jìn)行退火，連接形成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接，形成具有完整編碼序列的DNA；c將完整編碼的DNA與載體連接，導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)分子克隆。目前，還可以采用化學(xué)（連接）酶促相結(jié)合的方法合成寡聚核苷酸，可以提高反應(yīng)的專一性，減少副反應(yīng)，提高產(chǎn)率等。PrinciplesofGeneEngineering短的寡核苷酸片段連接成長(zhǎng)的基因的兩種方式小片段互補(bǔ)粘接大片段部分互補(bǔ)酶促PrinciplesofGeneEngineering化學(xué)合成寡核苷酸的應(yīng)用（1）合成分子雜交的探針；（2）合成PCR引物和DNA測(cè)序使用的引物；（3）合成短小的或來(lái)之不易的基因，或改造天然基因；（4）合成DNA末端改造中的接頭；（5）制備cDNA，篩選文庫(kù)，克隆基因；用于基因定位和基因的專一性改變等。PrinciplesofGeneEngineering人工合成基因的缺點(diǎn)合成的基因容易出現(xiàn)重復(fù)結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)或回文結(jié)構(gòu)，從而造成拼接效率下降或拼接錯(cuò)誤；小肽基因都比較短小，一般均采用化學(xué)合成的方法獲得其基因，如生長(zhǎng)激素釋放因子基因（14肽）、緩激肽、胸腺素-2、腦啡肽、加壓素、β干擾素、γ干擾素、人胰島素等。PrinciplesofGeneEngineering5.2基因文庫(kù)的構(gòu)建PrinciplesofGeneEngineering基因組文庫(kù)（genomiclibrary）：指整套由基因組DNA插入克隆載體所獲得的分子克隆的總合，其中應(yīng)該包含有生物的全部遺傳信息?；蛭膸?kù)包括兩種：cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）:

指細(xì)胞全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總合。PrinciplesofGeneEngineering基因組文庫(kù)的構(gòu)建一個(gè)基因組文庫(kù)中應(yīng)該含有多少克隆數(shù)目，才能保證所要求的基因以極高的頻率出現(xiàn)在文庫(kù)中？基因文庫(kù)大小N=ln(1-P)ln(1-F)N=基因文庫(kù)中所包含的克隆的數(shù)目P=任意所需基因存在于基因文庫(kù)中的概率，一般要求大于99%F=所克隆的DNA片段大小（kb）占基因組大小的分?jǐn)?shù)。根據(jù)公式可以計(jì)算出各步應(yīng)該達(dá)到的數(shù)量。PrinciplesofGeneEngineering如某動(dòng)物單倍體基因組含有3X109bp，使用噬菌體為克隆載體，所克隆的片段大小為20kb左右，為了使目的基因存在于基因組文庫(kù)的概率大于99%，則文庫(kù)中的克隆數(shù)目為69X105。大腸桿菌基因組為4.6X106，那么大腸桿菌基因文庫(kù)的克隆數(shù)是1100。由于原核生物基因組中不含有內(nèi)含子，所以可以認(rèn)為原核生物的基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)相同，但是真核生物就完全不同。PrinciplesofGeneEngineering基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程染色體DNA的提取載體的制備DNA部分酶切合適大小DNA片段的回收體外連接成重組分子轉(zhuǎn)化或感染進(jìn)入宿主細(xì)胞收集含有重組子的菌落，組成基因組文庫(kù)文庫(kù)的鑒定和擴(kuò)增文庫(kù)的保存基因組文庫(kù)的具體構(gòu)建過(guò)程可因材料、載體和宿主細(xì)胞的不同而有所差異。PrinciplesofGeneEngineering基因組文庫(kù)的構(gòu)建PrinciplesofGeneEngineering基因組文庫(kù)構(gòu)建的幾點(diǎn)說(shuō)明（1）提取基因組DNA時(shí)，要保證獲得大片段的DNAPrinciplesofGeneEngineering（2）目前多用部分酶切的方法使基因組DNA片段化。（3）酶切后“合適大小”片段的確定根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)而定。（4）載體種類的選擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蠖ǎ?）基因組文庫(kù)的鑒定就是要檢查庫(kù)的容量，也就是文庫(kù)中包含的克隆數(shù)，指菌落數(shù)或者形成的噬菌斑數(shù)目。PrinciplesofGeneEngineeringcDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)構(gòu)建的基本原理真核生物基因的結(jié)構(gòu)核表達(dá)控制元件與原核生物有很大不同，最大的差異就是具有內(nèi)含子序列；其次，真核生物的基因在某個(gè)給定的時(shí)刻只有部分表達(dá)，而且存在空間上的差異，許多mRNA基因具有組織特異性。mRNA由于不穩(wěn)定，所以研究時(shí)一般都反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行。為了研究基因的結(jié)構(gòu)、基因的表達(dá)譜以及將真核基因放在原核細(xì)胞中表達(dá)等，必須分離基因的cDNA，由此必須構(gòu)建基因的cDNA文庫(kù)。PrinciplesofGeneEngineering真核生物的各種基因表達(dá)豐度有很大的差異，有的有幾十萬(wàn)個(gè)拷貝，有的只有幾個(gè)拷貝。從文庫(kù)中克隆高豐度基因特別容易，但是克隆低豐度的基因卻比較困難。為了使低豐度基因的克隆存在的概率大于99%，cDNA文庫(kù)中應(yīng)該包含有的克隆數(shù)可以根據(jù)下面的公式計(jì)算：N=ln(1-P)ln(1-1/n)N=cDNA文庫(kù)中包含的克隆數(shù)目；p=低豐度cDNA存在于文庫(kù)中的概率，一般要求大于99%；1/n=每一種低豐度mRNA占總mRNA的分?jǐn)?shù)PrinciplesofGeneEngineering例如，人的成纖維細(xì)胞mRNA經(jīng)過(guò)分子雜交動(dòng)力學(xué)研究，一共有12000種分子，其中低豐度mRNA占總mRNA的30%，為11000種，所以n=11000/30%，為3.67x104，帶入上面公式，得到N=1.69x105。PrinciplesofGeneEngineering構(gòu)建cDNA文庫(kù)的基本步驟組織或細(xì)胞培養(yǎng)載體提取總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA體外連接為重組分子轉(zhuǎn)化重組子進(jìn)入宿主細(xì)胞收集含有重組子的細(xì)胞組成cDNA文庫(kù)文庫(kù)的鑒定和擴(kuò)增文庫(kù)的保存cDNA文庫(kù)的要求（1）含有各種稀有mRNA克?。唬?）克隆的cDNA應(yīng)該是全長(zhǎng)的，保留基因的5‘端序列。PrinciplesofGeneEngineeringcDNA兩條鏈的合成（回折法）PrinciplesofGeneEngineeringcDNA文庫(kù)的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)（1）文庫(kù)篩選比較容易；（2）得到基因的cDNA序列中無(wú)內(nèi)含子，可以用來(lái)研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，可以進(jìn)行表達(dá)獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)物；（3）利用cDNA做探針，可以認(rèn)識(shí)了解染色體結(jié)構(gòu)變化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用等。局限（1）cDNA不含基因的內(nèi)含子序列和基因的調(diào)控序列等。（2）低豐度基因有時(shí)難以在文庫(kù)中得到體現(xiàn)，難以分離。PrinciplesofGeneEngineering文庫(kù)質(zhì)量的鑒定PrinciplesofGeneEngineering5.3PCR法PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）的簡(jiǎn)稱，是DNA的體外酶促擴(kuò)增，又稱為“無(wú)細(xì)胞分子克隆法”。1985年由MullisK發(fā)明，為此他獲得諾貝爾獎(jiǎng)。KaryMullisPrinciplesofGeneEngineeringPCR的基本原理PCR方法模仿體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程，首先是使DNA變性，兩條鏈分開(kāi)，然后使用引物模板退火，二者堿基配對(duì)，DNA聚合酶隨即以四種dNTP為底物，在引物的引導(dǎo)下合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈，重復(fù)此過(guò)程，DNA以指數(shù)方式擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增時(shí)需要兩種引物，5’端引物和3‘端引物。5’端引物又叫正向引物、上游引物，3’端引物又叫反向引物、下游引物。PrinciplesofGeneEngineeringPCR操作簡(jiǎn)單，只需要加入試劑并控制3步溫度和時(shí)間即可，擴(kuò)增效率驚人：產(chǎn)量=（1+擴(kuò)增效率）循環(huán)次數(shù)PrinciplesofGeneEngineering12138192241416384381532768416166553653217131072664182621147128195242288256201048576951222419430410102424167772161120482667106864124096301073741824PrinciplesofGeneEngineeringPCR的基本過(guò)程分為三步：（1）模板變性：一般在94-95C進(jìn)行變性3-5分鐘。（2）退火：在合適的溫度下，引物和模板結(jié)合（3）引物延伸：在72C條件下，DNA聚合酶合成出新DNA鏈PrinciplesofGeneEngineeringPCR過(guò)程PrinciplesofGeneEngineeringPCR反應(yīng)條件控制要點(diǎn)（1）引物的設(shè)計(jì)：引物的質(zhì)量與PCR的成敗有最直接的關(guān)系（2）引物與模板的退火溫度：（3）反應(yīng)緩沖液中的Mg2+濃度；（4）模板：太多會(huì)影響反應(yīng)，最少可到皮克級(jí)。（5）DNA聚合酶：目前均使用耐熱的DNA聚合酶（6）四種dNTP

濃度要一致。PrinciplesofGeneEngineeringPCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用舉例（1）PCR技術(shù)的新發(fā)展：巢式PCR、復(fù)合PCR、RT-PCR、錨定PCR、反向PCR、不對(duì)稱PCR、重組PCR等等。（2）PCR用于特異性探針的合成（3）用于DNA的測(cè)序（4）產(chǎn)生和分析基因突變（5）重組PCR將DNA的不同序列連接在一起。（6）未知序列的PCR擴(kuò)增（反向PCR，鍋柄PCR）（7）基因組序列比較研究（8）在臨床醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（9）考古研究PrinciplesofGeneEngineering美國(guó)黃石國(guó)家公園的溫泉thehotspringsinYellowstoneNationalParkPrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineeringPCR還可以用于考古1991年在Alp發(fā)現(xiàn)的目前最古老的木乃伊(Otzi)，5200歲。ThroughthePCRtechnique,thisDNAwascopiedor"amplified"sufficientlytoallowscientiststolearnsomethingabouthisgeneticmakeup.PrinciplesofGeneEngineering5.4其他分離目的基因的方法人們針對(duì)一些基因的特殊性，還設(shè)計(jì)了許多獨(dú)特的方法來(lái)分離不同的基因。如染色體步行（walking）、染色體著陸（landing）、基因定位、基因表達(dá)文庫(kù)的建立等等。PrinciplesofGeneEngineering

6外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞6.1外源基因與載體的連接

6.1.1粘性末端DNA分子之間的連接

6.1.2平端DNA分子之間的連接

6.1.3粘平末端DNA分子之間的連接

6.1.4影響基因與載體之間連接的因素6.2重組分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞

6.2.1重組分子導(dǎo)入大腸桿菌

6.2.2重組分子導(dǎo)入酵母細(xì)胞

6.2.3重組分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞PrinciplesofGeneEngineering6.1外源基因與載體的連接經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶作用的目的基因和載體DNA，在連接酶的催化下，兩個(gè)雙鏈的DNA片段相鄰的5‘端磷酸與3’端的羥基之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程，叫做連接（ligation）,連接的結(jié)果是外源基因與載體分子連接成為一個(gè)新的雜交分子，叫做“重組子”，這個(gè)過(guò)程也叫做“DNA分子的體外重組”。DNA分子之間的連接可以分為幾種類型：（1）兩個(gè)末端均為粘性末端（2）兩個(gè)末端均為平端（3）一個(gè)末端為平端，一個(gè)末端為粘端PrinciplesofGeneEngineering6.1.1粘性末端DNA分子之間的連接兩個(gè)末端為同一內(nèi)切酶所切割形成：連接較為簡(jiǎn)單，但是載體自身連接問(wèn)題嚴(yán)重，轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的菌落中，由載體自身形成的連接占多數(shù)?？梢酝ㄟ^(guò)將5'端的磷酸基團(tuán)去磷酸化而解決。但是外源基因插入載體的方向有兩種可能性。PrinciplesofGeneEngineering兩個(gè)末端為不同的內(nèi)切酶所切割形成：這時(shí)載體自身無(wú)法連接，轉(zhuǎn)化后形成的重組子中載體自連極少，并且外源基因插入載體的方向可以確定，又叫定向克隆法PrinciplesofGeneEngineering6.1.2平端DNA分子之間的連接可以直接使用噬菌體的T4連接酶進(jìn)行連接，但是效率比較低，同時(shí)也存在載體自身環(huán)化、基因插入載體的方向無(wú)法確定等問(wèn)題。使用各種方法將平端改造為粘性末端進(jìn)行連接，常用的方法有:同聚物加尾法銜接物連接法接頭連接法等。平端的連接PrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineering在載體和目的基因兩端分別加上能夠相互配對(duì)的同一堿基聚合的單鏈的重組過(guò)程。由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行，加在DNA的3'端的羥基上，長(zhǎng)度可以達(dá)100個(gè)堿基左右，一般為20個(gè)堿基左右就可以了。同聚物加尾法PrinciplesofGeneEngineering銜接物（linker）是指使用人工合成的長(zhǎng)度為10-20個(gè)堿基，并具有一個(gè)或幾個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的平頭末端雙鏈寡核苷酸片段。人工接頭法就是指先將銜接物與平頭的目的基因連接，再使用銜接物中的內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生具有粘性末端的目的基因，再插到有粘性末端的載體中。銜接物連接法（人工接頭法）PrinciplesofGeneEngineering銜接物連接法（人工接頭法）PrinciplesofGeneEngineering單銜接物法：目的基因的兩端使用的是同一種銜接物，仍然會(huì)引起載體自身環(huán)化和基因不能定向插入的問(wèn)題。雙銜接物法：基因兩端使用不同的銜接物，酶切后產(chǎn)生不同的粘性末端。PrinciplesofGeneEngineering接頭（adaptor）是由華人科學(xué)家吳瑞1978年發(fā)明的。是一種人工合成的，一端為某種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，另一端為平端的特殊雙寡核苷酸片段。它的平端與目的基因的平端連接之后會(huì)使目的基因具有了粘性末端，這樣與載體之間的連接易于進(jìn)行。實(shí)際操作時(shí)，將接頭粘性末端的5'端去磷酸化，使得自身無(wú)法環(huán)化。待平端部分與目的基因連接后，再使用激酶將5’端磷酸化進(jìn)行連接。接頭連接法PrinciplesofGeneEngineering1981年中美生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合招生項(xiàng)目（China-UnitedStatesBiochemistryandMolecularBiologyExaminationandApplicationProgram，簡(jiǎn)稱CUSBEA項(xiàng)目），PrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineering6.1.3粘平末端DNA分子之間的連接一個(gè)末端為平端，一個(gè)末端為粘端片段之間的連接,可以直接連接，或者將平端改造為粘端再連接。PrinciplesofGeneEngineering6.2重組分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞受體細(xì)胞又叫“宿主細(xì)胞”，原核的宿主細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌等；真核宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（包含組織培養(yǎng)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、個(gè)體等等）。PrinciplesofGeneEngineering受體細(xì)胞一般不是天然的基因型，為了適合操作，一般均進(jìn)行了改造，如大腸桿菌是限制性內(nèi)切酶缺陷型，DNA重組缺陷型等；同時(shí)為了便于重組子的篩選，受體細(xì)胞往往是某一種基因功能缺陷型的；此外，為了基因工程的安全，宿主細(xì)胞不能具有感染性。同時(shí)宿主細(xì)胞應(yīng)該易于生長(zhǎng)，便于篩選。對(duì)于有害基因的克隆，宿主細(xì)胞有更高的要求。PrinciplesofGeneEngineering1970年，Mandel和Higa將大腸桿菌置于冰冷的CaCl2溶液中，然后瞬間加熱，外源的噬菌體DNA即高效的轉(zhuǎn)染大腸桿菌。這種方法廣泛使用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)有許多改進(jìn)。但是機(jī)理還不是完全清楚。外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，改變細(xì)胞遺傳性狀的叫轉(zhuǎn)化（transformation）;將病毒DNA或病毒重組DNA直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞叫“轉(zhuǎn)染（transfection）,”與病毒的“感染（infection）”相區(qū)別。（1）氯化鈣轉(zhuǎn)化法PrinciplesofGeneEngineering采用脈沖高壓瞬間擊穿細(xì)胞膜使外源DNA高效進(jìn)入細(xì)胞。適用對(duì)象十分廣泛，動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、藻類等均可。儀器較貴，但是效率高，比較常用。（2）電穿孔法（電擊法）PrinciplesofGeneEngineering使用Ca2+沉淀磷酸離子和DNA，沉積在細(xì)胞膜上的DNA被細(xì)胞吸收?？赡苁峭ㄟ^(guò)吞噬作用。用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。成本低，操作方便，但是效率也低。（3）磷酸鈣共沉淀法PrinciplesofGeneEngineering利用類脂經(jīng)過(guò)超聲波、機(jī)械攪拌等可以形成雙脂層小囊泡，將DNA包裹其中，它通過(guò)與細(xì)胞膜的融合而使DNA進(jìn)入細(xì)胞。（4）脂質(zhì)體（liposome）PrinciplesofGeneEngineering對(duì)于較大的哺乳動(dòng)物的受精卵，可以在顯微鏡下操作，用極細(xì)的玻璃注射針頭直接插入細(xì)胞內(nèi)將DNA溶液注射到細(xì)胞內(nèi)。效率極高，但是儀器昂貴操作復(fù)雜，技術(shù)不易掌握。（5）顯微注射法顯微注射法PrinciplesofGeneEngineering俗稱基因槍法，使用直徑為1um的惰性重金屬（鎢或金）粉末作為微彈，將DNA與粉末混合，使用高壓氣體發(fā)射彈頭，微彈高速射入細(xì)胞。這種方法效率很高。常用于植物基因工程中的轉(zhuǎn)化。在動(dòng)物中也可以使用。（6）高速微彈發(fā)射裝置法PrinciplesofGeneEngineering7重組體的鑒定和分析外源基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，會(huì)形成龐大的宿主細(xì)胞群體，如何從這些細(xì)胞中分離到含有重組子的細(xì)胞使一個(gè)重要而繁雜的事情，特別是從基因文庫(kù)中篩選尤甚。現(xiàn)在雖然設(shè)計(jì)出許多巧妙的方法，但是總的說(shuō)來(lái)，重組子的篩選還是一件工作量比較大的事情。篩選含有重組子的細(xì)胞一般基于載體的特征或目的基因的序列特征或產(chǎn)物特征PrinciplesofGeneEngineering一般載體都有可篩選的遺傳標(biāo)記，最常用的是抗藥性篩選標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和顯色標(biāo)記，對(duì)于噬菌體來(lái)說(shuō)，噬菌斑的形成是自我選擇的結(jié)果。7.1載體特征的篩選PrinciplesofGeneEngineering常使用的是氨芐青霉素抗性標(biāo)記（ampr）、氯霉素抗性標(biāo)記（chlr）、四環(huán)素抗性標(biāo)記（tetr）等。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有這種抗生素的培養(yǎng)基中就可以進(jìn)行篩選。將外源基因插入抗性基因編碼序列內(nèi)，可以通過(guò)插入失活的方式篩選?？顾幮詷?biāo)記：PrinciplesofGeneEngineering營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記：細(xì)胞生物合成途徑中某個(gè)酶編碼的基因失活，就可以稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，但是如果導(dǎo)入細(xì)胞的重組子DNA可以彌補(bǔ)缺陷的基因，培養(yǎng)基中就可以無(wú)須加入有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)成分。PrinciplesofGeneEngineeringβ-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法：當(dāng)載體的lacZ區(qū)插入外基因后就喪失了編碼α-肽的能力，帶有外源基因插入的菌落呈白色，不帶有外源基因的菌落成蘭色，非常便于重組子的篩選。PrinciplesofGeneEngineering載體基因中含有大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因LacZ’的啟動(dòng)子和編碼的部分(N端部分)α肽鏈的基因(統(tǒng)稱LacZ’基因),在LacZ’基因中靠近5‘端有一個(gè)多克隆位點(diǎn)(如果有外源基因插入多克隆位點(diǎn)就會(huì)導(dǎo)致LacZ’基因的失活),另外還有一個(gè)調(diào)節(jié)LacZ基因活性的基因LacI.這種質(zhì)粒的宿主細(xì)胞是一種β-半乳糖苷酶基因缺陷型,只能編碼基因的C端一部分.當(dāng)這種質(zhì)粒生長(zhǎng)在這種缺陷型細(xì)菌中時(shí),在一定條件下能發(fā)生“互補(bǔ)”,使細(xì)胞具有正常的β-半乳糖苷酶活性。PrinciplesofGeneEngineering在利用LacZ基因來(lái)篩選重組子時(shí),在細(xì)菌的培養(yǎng)基中加入LacZ基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物---IPTG,當(dāng)沒(méi)有外源基因插入載體中的多克隆位點(diǎn)時(shí),LacZ基因可以轉(zhuǎn)錄翻譯,質(zhì)粒和細(xì)菌β-半乳糖苷酶發(fā)生互補(bǔ)而具有活性,將同時(shí)加入的底物X-gal分解產(chǎn)生蘭色菌落.如果有外源基因插入載體,則LacZ基因不能正常轉(zhuǎn)錄翻譯,互補(bǔ)就不能發(fā)生,菌落呈白色。重組子的藍(lán)白斑篩選PrinciplesofGeneEngineeringPrinciplesofGeneEngineering

7.2利用目的基因特征進(jìn)行篩選細(xì)菌菌落或噬菌斑的原位雜交利用序列相同或相近的DNA序列一定條件下可以退火，形成雜種分子的原理，使用一段與目的基因相同或近似的DNA做為“探針（probe）”，與篩選對(duì)象中含有的DNA雜交，然后再檢測(cè)雜種分子，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)含有目的基因（或片段）的重組細(xì)胞。PrinciplesofGeneEngineering平板上待篩選的細(xì)胞群體通過(guò)特制的工具將菌落轉(zhuǎn)移到膜