雙酚a暴露斑馬魚的繁殖性能及其對毒性的影響

雙酚a（bpa）的毒性研究主要集中在其內部干擾上。例如，根據外部人類乳腺癌mcf-7的細胞移植試驗，bpa對mcf-7細胞的移植具有明顯的刺激性。此外，bpa對非靶器官的影響日益引起人們的關注。國外的研究表明，bpa可以轉化為一種添加劑，具有潛在的遺傳毒性和胚胎毒性。本研究對斑馬魚的不同發(fā)育階段(胚胎、仔魚和成魚)進行BPA毒性測試,比較了它們的敏感指標及適用范圍;考察了胚胎和成魚對BPA的吸收水平,分析了它們對BPA蓄積能力的區(qū)別;探討了BPA對DNA的損傷作用.1材料和方法1.1bpa濃度的確定將斑馬魚(雌雄比1∶2)飼養(yǎng)在水族箱中,水溫26±1℃、光照/黑暗周期14/10h,每日喂2次冷凍搖蚊幼蟲(來自非污染水域).飼養(yǎng)用水經生物過濾器過濾并充分曝氣,pH值為8左右.培養(yǎng)一個月后開始收集魚卵.稱取一定量的BPA(純度98.5%)粉末,加入少量無水乙醇助溶(實際暴露溶液中乙醇的濃度不超過0.01%,經溶劑對照試驗,此濃度對試驗結果無影響),再溶于重組水中,稀釋到需要的濃度.本試驗的BPA濃度分別為0.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00,15.00,18.00,22.00和25.00mg·l-1.1.2不同濃度bpa的觀察和測定胚胎試驗將BPA溶液加入到24孔細胞培養(yǎng)板中,每孔加入2ml,放一枚發(fā)育良好的受精卵,進行零時(卵產出后受精1h內)染毒試驗.每塊板中4個孔為空白對照(加重組水),其余20個孔為同一試驗濃度.加蓋后用透明膠帶封好,以避免蒸發(fā)而改變試驗濃度.放入26±1℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).從得到魚卵開始計時,按照OECD標準方法定時觀察并記錄發(fā)育過程中的毒理學終點.仔魚試驗參照胚胎試驗方法,將BPA溶液加到24孔細胞培養(yǎng)板中,每孔中加入一條經鏡檢發(fā)育正常的孵化24h內的仔魚(卵產出后96h).在24h和48h觀察并記錄發(fā)育過程中的毒理學終點.成魚試驗參照國家標準方法,分別加1.00L含有不同BPA濃度梯度的溶液到1.00L燒杯中,每個燒杯中放入10條正常成魚,每24h更新一次試驗液,觀察致死和中毒反應.1.3斑馬魚花卵中bpa和半效應值的檢測參照肖全偉等的方法進行雙酚A測定.HPLC色譜儀(Waters2475),C18柱(3.9×150mm,5μm,Waters);熒光檢測器(Waters2475).流動相為乙腈-0.01mol·l-1乙酸銨緩沖液(pH4.5,體積比為75∶25),流速1ml·min-1;柱溫:25℃;激發(fā)波長(λex):227nm;發(fā)射波長(λem):313nm;進樣量:20μl.空白對照組選取實驗室馴養(yǎng)6個月后的斑馬魚2尾,每條約0.30g(濕重);搖蚊幼蟲2組,每組2.00g(濕重);重組水5.00ml.實驗組選取1000顆0h受精胚胎(64.00±6.00mg,干重)和實驗室馴養(yǎng)6個月后的斑馬魚2尾(198.90±0.20mg,干重),分別用5.00mg·l-1BPA染毒48h.用干重計算單位質量胚胎和魚中的BPA含量.參照張清敏等建立的方法進行DNA鏈斷裂檢測,每組取20顆斑馬魚魚卵,在玻璃勻漿器中加入200μlTE(50mmol·l-1Tris-HCl,20mmol·l-1EDTA,pH8.2)低溫勻漿,以5000r·min-1在4℃離心10min,小心倒出上清液去除RNA,加入10μlTE溶解沉淀.取6μl沉淀的溶解液和2μl裂解液(2mol·l-1NaOH與10%SDS等體積混勻)和2μl溴酚藍混勻,室溫裂解10min后,加到0.5%瓊脂糖膠板孔穴中,以0.5×TBE溶液為電泳緩沖液,在4℃、25V電壓下電泳1—2h,用ImageMasterVDS(PharmaciaBiotech)進行成像分析.每個試驗組設三個平行樣,由線性相關性分析半致死濃度和半效應濃度;組內進行t檢驗,組間用AVONA檢驗,P<0.05表示有顯著差異.2結果與討論2.1半效應濃度ec50斑馬魚胚胎經零時染毒試驗,24h的半致死濃度(LC50)為16.4±0.40mg·l-1,其中染毒8h(原腸胚外包期)后,最高試驗濃度25.00mg·l-1全部死亡.亞致死毒性作用表現(xiàn)為:染毒4h(囊胚發(fā)育期)時胚胎產生卵凝結,半效應濃度(EC50)=13.36±0.56mg·l-1;染毒32h后發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育遲緩,EC50=15.0±0.80mg·l-1;染毒48h后,空白對照組平均孵化率為75.00%,而染毒組在2.00mg·l-1的孵化率僅為40.00%,10.00mg·l-1的孵化率為零,孵化明顯延遲,6.00mg·l-1組開始產生心包囊水腫,并隨著濃度的增加其比例增大;染毒72h后,抑止孵化率的EC50=13.0±0.50mg·l-1,高濃度組(10.00—25.00mg·l-1)個別孵化出的仔魚出現(xiàn)尾畸和脊椎彎曲.因此,胚胎亞致死敏感效應表現(xiàn)為:卵凝結,孵化率降低>血流障礙>心包囊水腫>尾畸和脊椎彎曲.2.2效應百分率和死亡現(xiàn)象仔魚最敏感的亞致死效應為血流障礙,并且隨時間的延長,BPA的毒性增大(圖1).24h血流障礙EC50=12.39mg·l-1,無效應濃度(NOEC)為6.00mg·l-1,25.00mg·l-1時該效應百分率達到100%;24h在18.00mg·l-1時沒有觀察到死亡現(xiàn)象,但此濃度下,20.00%出現(xiàn)脊椎彎曲現(xiàn)象,而在25.00mg·l-1時全部死亡,24h的LC50在18.00—25.00mg·l-1之間;48h的死亡無效應濃度為2.00mg·l-1,LC50=7.75mg·l-1.說明BPA暴露下,48h比24h的致死性明顯增強.高濃度組(10.00—25.00mg·l-1)個別仔魚有心包囊水腫、尾折現(xiàn)象.2.3斑馬魚的光催化毒性中毒的成魚表現(xiàn)為活動性降低、沉底及側游,但無明顯的外部形態(tài)變化.死亡魚體色發(fā)白,有白色膜狀物附著在魚體,可能為魚體表分泌物,魚胸鰭處出現(xiàn)血紅色.隨著溶液中BPA濃度的增大,水的濁度增大,并且濁度變化與濃度變化有明顯的相關性(R2=0.94,圖2).其中斑馬魚在10.00mg·l-1以上的BPA溶液中暴露24h染毒后全部死亡,8.00mg·l-1暴露24h成魚的死亡率為40%,6.00mg·l-1在24h暴露過程中無任何癥狀(圖3).24h的LC50值在8.00—10.00mg·l-1之間.2.4不同體系中各成魚對bpa的生物蓄積能力未染毒斑馬魚、搖蚊幼蟲以及對照溶液中均未檢出雙酚A.5mg·l-1BPA在48h連續(xù)暴露下,胚胎和成魚體內的含量分別為373.57±39.76μg·g-1和155.78±17.97μg·g-1,它們之間有顯著差異(P=0.016,n=3).為便于比較,用μg·g-1(相當于μg·ml-1)表示水相濃度,相應地胚胎和成魚對水體中BPA的生物蓄積倍數(shù)分別為74.7±7.95和31.16±3.59,即胚胎在5mg·l-1BPA水溶液中的蓄積能力大約是成魚的兩倍.2.5成魚、仔魚和bpa的致病性差異DNA鏈斷裂分為單鏈斷裂(Ⅰ型)和雙鏈斷裂,雙鏈斷裂又分為雙鏈在非同一堿基對的斷裂(Ⅱ型)和雙鏈在同一堿基對的斷裂(Ⅲ型),當進行電泳時,發(fā)生雙鏈或單鏈斷裂的DNA泳動速度就會發(fā)生改變,通過圖像分析儀的分析,會發(fā)現(xiàn)DNA條帶不同,以此檢測是否有DNA損傷存在.本試驗雖然不能確切區(qū)分出不同DNA的斷裂情況,但是對染毒組的DNA損傷還是可以判別的.對照組只有超螺旋DNA的一條帶,而5.00mg·l-1和15.00mg·l-1BPA染毒組除有上述條帶以外,還有明顯的斷裂帶存在,證明在5.00mg·l-1和15.00mg·l-1BPA暴露下,對斑馬魚胚胎造成了DNA損傷.從BPA的致死效應上進行分析,斑馬魚胚胎24h的LC50為16.4±0.40mg·l-1,仔魚24h在18.00mg·l-1時沒有觀察到死亡現(xiàn)象,成魚24h的LC50在8.00—10.00mg·l-1之間,在對BPA的24h致死敏感性上表現(xiàn)為:成魚>胚胎>仔魚.但是仔魚48h的LC50降低到7.75mg·l-1,基本與成魚48h的LC50(8.00—10.00mg·l-1,與24h的LC50相同)持平,而胚胎48h的LC50為14.75±0.50mg·l-1,相對胚胎24h的LC50(16.4±0.40mg·l-1)變化不大,因此,48h致死敏感性上表現(xiàn)為:成魚,仔魚>胚胎.這與McKenney等對河蝦的研究相一致.分析其原因,一般認為成魚能夠通過攝食、鰓部呼吸和皮膚吸收來富集污染物,而剛孵化的仔魚24h不能自主呼吸和攝食,48h后才發(fā)育到成魚的功能,所以表現(xiàn)出成魚和仔魚致死敏感性上的區(qū)別.而胚胎對BPA的蓄積能力大于成魚,但是從24h和48h致死率的數(shù)據來看,胚胎不如成魚敏感,說明胚胎對BPA的耐受性大于成魚.同時,在亞致死效應方面,其敏感性在胚胎表現(xiàn)出孵化率降低>血流障礙>心包囊水腫>尾畸和脊椎彎曲,在仔魚表現(xiàn)出血流障礙>脊椎彎曲,而成魚無明顯外部形態(tài)變化,只是分泌物增多,使溶液的濁度明顯增大.進一步證實了成魚更傾向于表現(xiàn)出急性毒性效應,而胚胎更傾向于表現(xiàn)出亞急性毒性效應和致畸效應.胚胎發(fā)育異?？赡苁怯捎贐PA作用于動物臟層卵黃囊(VYS)造成的,龍鼎新等發(fā)現(xiàn)60mg·l-1以上的BPA在影響培養(yǎng)大鼠胚胎生長發(fā)育的同時,對VYS血管分化有不良效應,提示其造血功能降低,使得胚胎生長發(fā)育所需的氧和營養(yǎng)物質得不到供應,造成胚胎缺氧和新陳代謝紊亂.5mg·l-1BPA濃度下,雖然胚胎沒有表現(xiàn)出外在的致死或亞致死效應,但仍然發(fā)現(xiàn)DNA損傷作用,而DNA損傷可能會造成遺傳信息的改變,從而導致遺傳毒性.BPA可經生物氧化作用生成醌雙酚A,這種中間體與dGMP結合,與細胞DNA發(fā)生不可逆的共價反應形成DNA加合物.BPA及其活性中間產物與DNA形成配體、或作用于染色體的特定部位及BPA的脂質過氧化作用等,都有可能直接損傷染色體而引起畸變率升高.3斑馬魚胚胎與急性毒性比較5.00mg·l-1B