人肝蛋白質(zhì)分離體系色譜分離柱的選擇

隨著人類科學(xué)研究的結(jié)束，蛋白質(zhì)組學(xué)成為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。相對(duì)于基因組學(xué)而言,由于蛋白質(zhì)表達(dá)的多樣性和翻譯后修飾的復(fù)雜性,其研究更加依賴于新技術(shù)新方法的發(fā)展。生物色譜與質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的迅猛發(fā)展,形成了基于完整蛋白質(zhì)分離的Top-down路線和基于肽段串級(jí)質(zhì)譜鑒定的Bottom-up路線。雙向凝膠電泳技術(shù)盡管在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要性眾所周知,然而其本身仍存在一些難以克服的缺陷,如動(dòng)態(tài)范圍有限,對(duì)樣品中低豐度蛋白質(zhì)、疏水蛋白質(zhì)以及極酸極堿性蛋白質(zhì)的分辨能力較差,操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力等;Bottom-up技術(shù)路線需先進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解,此步驟產(chǎn)生了比蛋白質(zhì)樣品更加復(fù)雜的酶解肽段,對(duì)色譜的分離能力和質(zhì)譜的鑒定速度提出了挑戰(zhàn),還會(huì)損失完整蛋白質(zhì)的信息。高效液相色譜(HPLC)技術(shù)具有快速、高效、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),根據(jù)Giddings的多維分離系統(tǒng)數(shù)學(xué)模型,通過有效正交實(shí)現(xiàn)聯(lián)用的多維液相色譜分離技術(shù)具有更大的峰容量,可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的高效分離,而且可以通過增大上樣量來分離富集中低豐度蛋白質(zhì),因而得到了廣泛的應(yīng)用。以往的研究多采用蛋白質(zhì)酶解肽的多維色譜分離策略,但是越來越多的事實(shí)表明,基于蛋白質(zhì)水平的分離與鑒定更加可靠,而且可以獲得蛋白質(zhì)含量、后修飾等重要信息。高明霞等利用構(gòu)建的強(qiáng)陽離子交換色譜/反相高效液相色譜(SCX/RPLC)分離系統(tǒng),對(duì)鼠肝蛋白質(zhì)進(jìn)行了兩維高效分離并將高豐度蛋白質(zhì)高效去除,大大提高了蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和可靠性。通過多維液相色譜高效分離實(shí)現(xiàn)Top-down技術(shù)路線分析正成為研究的主要方法。這種基于完整蛋白質(zhì)分離的策略其關(guān)鍵還是要提高復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離效率,而和SCX色譜柱比較,弱陰離子交換作為第一維色譜可以減少樣品酸化過程的損失,增大蛋白質(zhì)的上樣量;RPLC對(duì)多維液相色譜總峰容量的貢獻(xiàn)很大,可以提高復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分辨率,將其作為第二維色譜還可以在線除鹽。因此,優(yōu)化離子交換色譜/RPLC二維分離系統(tǒng)對(duì)于蛋白質(zhì)的分離有重要的應(yīng)用意義。本研究對(duì)二維分離系統(tǒng)的核心——色譜柱進(jìn)行了篩選,并系統(tǒng)評(píng)價(jià)和考察了其分離性能,解決了蛋白質(zhì)水平兩維色譜分離系統(tǒng)中色譜柱的最優(yōu)化問題。1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料和試劑島津LC-2010高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司),配有泵單元、四元低壓梯度單元、溶劑真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外可見檢測器和CLASS-VP工作站。十萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司),數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)DS-5510DTH,上海生析超聲儀器有限公司)。甲醇(HPLC純,美國Fisher公司),乙腈(ACN,HPLC純,德國Merck公司),三氟乙酸(TFA,HPLC純,美國Sigma公司);標(biāo)準(zhǔn)蛋白細(xì)胞色素C(cytochromeC,Cyt-C)、馬心肌紅蛋白(myoglobin,MYO)和雞卵白蛋白(albuminfromchickeneggwhite,ALB)購自美國Sigma公司;用于色譜柱測試的化合物尿嘧啶、硝基苯、萘、芴為分析純,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司上海分公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水。健康人肝組織樣品由中國人肝組織提供。二硫蘇糖醇(DTT)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和苯甲磺酰氟(PMSF)為Amresco(USA)分裝,購自上海華舜生物工程有限公司?？捡R斯亮藍(lán)R-250(Bio-Rad,USA)。樣品制備:將人肝組織切成小塊,用冰生理鹽水(0.9%NaCl溶液)清洗3次以除去體液及血液中一些可能的污染物。然后稱重,以1∶8(g∶mL)的比例加入提取液(1mmol/LPMSF,50mmol/LDTT,10mmol/LTris-HCl,pH7.5),然后置于玻璃勻漿器內(nèi)進(jìn)行手動(dòng)勻漿至組織完全破碎,上述整個(gè)勻漿過程在冰浴中進(jìn)行。勻漿液混旋30min,在4℃條件下15000g離心30min,取上清液即為提取蛋白,-80℃保存?zhèn)溆?蛋白質(zhì)提取液用Bradford法定量。1.2實(shí)驗(yàn)步驟1.2.1tis-hcl的流動(dòng)相及洗脫梯度蛋白質(zhì)弱陰離子交換(WAX)柱:TosohTSKgelDEAE-5PW(東京,日本),內(nèi)徑是7.5mm,柱長為75mm,采用10μm,100nm填料,分析柱前加一個(gè)2cm長、內(nèi)徑為4.6mm的保護(hù)柱以防止污染或堵塞分析柱,保護(hù)柱的填料粒徑為20μm。流動(dòng)相A:10mmol/LTris-HCl(pH7.5);流動(dòng)相B:10mmol/LTris-HCl-500mmol/L氯化鈉(pH7.5)。流動(dòng)相流速設(shè)定為0.5mL/min。流動(dòng)相洗脫梯度為:0%B15min,于80min內(nèi)線性上升至30%B,于22min內(nèi)線性上升至100%B,保持5min,于3min內(nèi)降至0%B。上樣量為2mg/次,平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。收集的餾分經(jīng)過冷凍干燥后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2色譜條件及色譜柱的確定以尿嘧啶、硝基苯、萘和芴為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別稱取一定質(zhì)量的上述4種化合物,以甲醇作為溶劑,配制成1g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。使用時(shí)取等體積的上述4種標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,并加入30%ACN水溶液稀釋至終質(zhì)量濃度為0.1g/L。RPLC色譜柱規(guī)格:250mm×4.6mm,粒徑5μm,孔徑30nm,硅膠基質(zhì),鍵合固定相為C4、C8或C18,購自國內(nèi)外不同廠家,詳細(xì)參數(shù)見表1。柱效評(píng)價(jià)采用色譜柱出廠報(bào)告上的色譜條件,樣品進(jìn)樣體積為5μL。1.2.3流動(dòng)相a/2.0分別稱取一定質(zhì)量的Cyt-C、MYO和ALB3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品,以去離子水作為溶劑,配制成10g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。使用時(shí)取等體積的上述3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液混合,并加入去離子水稀釋至終質(zhì)量濃度為1g/L。色譜條件:流動(dòng)相A:95%H2O-5%ACN-0.05%TFA;B:95%ACN-5%H2O-0.05%TFA。流動(dòng)相洗脫梯度為:10min內(nèi)由0%B線性上升至25%B,20min內(nèi)由25%B線性升至40%B,8min內(nèi)由40%B線性升至80%B,3min內(nèi)降至0%B。流速設(shè)定為1mL/min。檢測波長為215nm。樣品進(jìn)樣體積為30μL。定量方法使用面積歸一化法。1.2.4rplc分離條件的確定樣品準(zhǔn)備:取一定量的一維WAX凍干餾分溶解于1.2.3節(jié)RPLC的流動(dòng)相A相,充分混旋,離心,取上清溶液備用,溶液中蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測定,由此確定二維RPLC的上樣量,保證每根色譜柱的分離分析條件的一致性。色譜條件同1.2.3節(jié)。2結(jié)果與討論2.1流動(dòng)相梯度條件的確定常用的離子交換色譜柱有陽離子交換柱和陰離子交換柱,陽離子交換色譜通常需在酸性條件下上樣,但在中性溶液中提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過酸化處理會(huì)導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)沉淀,使用陰離子交換色譜則能夠避免蛋白質(zhì)沉淀。陰離子交換色譜柱有強(qiáng)陰離子交換和弱陰離子交換兩種,在蛋白質(zhì)分離中應(yīng)用比較廣泛的是弱陰離子交換色譜柱,因此本研究選擇了兩款弱陰離子交換柱進(jìn)行比較。如圖1所示,無孔的弱陰離子交換柱TSKgelDEAE-NPR(圖1b)盡管對(duì)于一些在大孔弱陰離子交換柱TSKgelDEAE-5PW(圖1a)上強(qiáng)保留的蛋白質(zhì)分離效果比較好,分離速度也比較快,但色譜柱的樣品容量小,不能滿足二維色譜分離過程中第二維上樣量的需要,因此實(shí)驗(yàn)選取了具有更大上樣量的弱陰離子交換柱TSKgelDEAE-5PW進(jìn)行人肝蛋白質(zhì)樣品的第一維分離。通過對(duì)梯度條件的優(yōu)化,最終確定了圖1中使用的流動(dòng)相梯度條件。1D-WAX餾分收集采用按色譜峰收集的方法,具體如圖2中所示,每次上樣2mg,重復(fù)進(jìn)樣3次平行收集餾分,然后凍干,置于-80℃冰箱中保存以便進(jìn)行2D-RPLC色譜條件的考察優(yōu)化。由圖2也可以看出,在優(yōu)化后的色譜條件下,3次平行進(jìn)樣的色譜分離重現(xiàn)性很好。2.2rlc-色譜柱效測試2.2.1色譜柱組成對(duì)填料含碳量的影響以尿嘧啶、硝基苯、萘和芴為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)色譜柱柱效進(jìn)行評(píng)價(jià)。液相色譜系統(tǒng)的死時(shí)間以尿嘧啶的出峰時(shí)間計(jì),理論塔板數(shù)按芴來計(jì)算,根據(jù)島津LC-2010自帶的工作站CLASS-VP軟件,計(jì)算色譜峰的不對(duì)稱因子(As)、理論塔板數(shù)(NT)和有效塔板數(shù)(Neff)等色譜柱參數(shù),具體結(jié)果詳見表2。As:asymmetryfactor;NT:theoreticalplatenumber;Neff:effectiveplatenumber;△P:columnbackpressure(100%mobilephaseA);ALB:albuminfromchickeneggwhite.由上述結(jié)果可以看出色譜柱4、9、10的柱效較低,由表1可以看出它們的填料含碳量較低;色譜柱6柱效較高,柱壓降也比較高,可能是色譜柱的填料裝填比較緊密;色譜柱1、2、3、5和8的柱效比較接近,需要比較其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的分離情況以作進(jìn)一步的篩選考察。2.2.2基化烷tmscl處理硅膠基質(zhì)的色譜填料具有傳質(zhì)快、不溶脹、耐高壓等優(yōu)點(diǎn)。通過在多孔硅膠基質(zhì)表面鍵合不同的功能基團(tuán)如氨基、氰基、二醇基、烷基等可以制備具有多種功能性質(zhì)的色譜填料。反相色譜填料通常是在硅膠基質(zhì)表面鍵合上不同長度的烷基鏈如C4、C8和C18等,殘余的自由硅羥基使用“封尾”試劑如三甲基氯硅烷(TMSCl)進(jìn)行烷基化處理,以消除其對(duì)樣品分離過程的不利影響。然而隨著烷基化程度的提高,位阻造成的影響使少量硅羥基難以被完全硅烷化,所以不同生產(chǎn)廠家的色譜柱在使用過程中對(duì)樣品的非特異性吸附也不同,對(duì)于珍貴的人肝蛋白質(zhì)樣品來講,考察不同填料對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附非常重要。本文采用Cyt-C、MYO和ALB做標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進(jìn)行考察,通過對(duì)照空白實(shí)驗(yàn)并利用面積歸一化法對(duì)蛋白質(zhì)在不同色譜柱上的殘留進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cyt-C與MYO在所測試的色譜柱上幾乎沒有殘留,而ALB的殘留相對(duì)比較大,這可能與ALB的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較大而疏水性更強(qiáng)有關(guān),表2給出了ALB的非特異性吸附的數(shù)據(jù)?？梢钥闯?色譜柱4、7和10的非特異性吸附比較弱;色譜柱6、8和9的非特異性吸附較強(qiáng);色譜柱1、2、3和5的測試結(jié)果比較接近。綜合考慮柱效、柱壓降、蛋白質(zhì)的非特異性吸附以及色譜柱填料的比表面積、含碳量、使用的pH范圍,選取色譜柱1和2作進(jìn)一步的研究。2.3wys分離的第二維色譜柱圖3是RP色譜柱1、2對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品Cyt-C和ALB的分離圖,可以看出兩款色譜柱對(duì)ALB的分離峰形都比較好;但是對(duì)于Cyt-C的分離,色譜柱2具有更好的分離度。之后,實(shí)驗(yàn)選用了1D-WAX的餾分6(見圖2)對(duì)兩根色譜柱做進(jìn)一步的考察。通過色譜圖(見圖4)的比較可以發(fā)現(xiàn)保留能力一般的蛋白質(zhì)樣品在色譜柱1和色譜柱2上具有相似的分離能力;而對(duì)于強(qiáng)保留的蛋白質(zhì)即疏水性比較強(qiáng)的蛋白質(zhì),色譜柱2具有更加優(yōu)越的分離性能。因此色譜柱2(Jupiter300C4,美國Phenomenex公司)被選作人肝蛋白質(zhì)樣品多維色譜分離的第二維色譜柱。這樣就可以在第一維盡量不損失樣品完整性的基礎(chǔ)上,最大程度地提高蛋白質(zhì)在第二維的分離效率,不僅可以得到更多中低豐度蛋白質(zhì)的峰信息,方便地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,還可以簡化后續(xù)的液相色譜餾分中蛋白質(zhì)的復(fù)雜程度,提高其質(zhì)譜鑒定效率。