第三章微生物的生長及生長條件第一節(jié)微生物生長及測(cè)定第二節(jié)微生物群體的生長規(guī)律第三節(jié)微生物的生長條件及其控制第一節(jié)微生物生長1微生物生長的概念微生物在適宜的外界環(huán)境條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按自身的代謝方式進(jìn)行新陳代謝，如同化作用大于異化作用，其結(jié)果是原生質(zhì)的總量（包括重量、體積、大小）不斷地增加，稱為微生物的生長現(xiàn)象。生長定義為微生物細(xì)胞在群體水平上增加，也可以認(rèn)為是微生物群體數(shù)量增加。許多微生物是以二分裂的方式生長的。一般細(xì)胞分裂和染色體復(fù)制是協(xié)調(diào)控制的。單細(xì)胞微生物如細(xì)菌的生長，往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加。當(dāng)細(xì)胞增長到一定程度時(shí)，就以二分裂方式，形成兩個(gè)相似的子細(xì)胞，子細(xì)胞又重復(fù)上述過程，使細(xì)胞數(shù)目增加，稱為繁殖。在多細(xì)胞微生物中，例如某些霉菌，細(xì)胞數(shù)目的增加如不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增加，只能叫生長，不能叫繁殖。例如菌絲細(xì)胞的不斷延長或分裂產(chǎn)生同類細(xì)胞均屬生長，只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個(gè)體數(shù)目增加的過程才叫做繁殖。第二節(jié)微生物群體生長的規(guī)律微生物的群體生長規(guī)律單細(xì)胞的微生物，如細(xì)菌、放線菌在液體培養(yǎng)基中，可以均勻地分布，每個(gè)細(xì)胞接觸的環(huán)境條件相同，都有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，故每個(gè)細(xì)胞都迅速地生長繁殖。霉菌多數(shù)是多細(xì)胞微生物，菌體呈絲狀，在液體培養(yǎng)基中生長繁殖的情況與單細(xì)胞微生物不一樣，如果采取搖床培養(yǎng)，則霉菌在液體培養(yǎng)中的生長繁殖情況，近似于單細(xì)胞微生物。因液體被攪動(dòng)，菌絲處于分布比較均勻的狀態(tài)，而且菌絲在生長繁殖過程中不會(huì)像在固體培養(yǎng)基上那樣有分化現(xiàn)象，孢子產(chǎn)生也較少。（1）典型的生長曲線微生物生長繁殖的速度非?？欤话慵?xì)菌在適宜的條件下，大約20~30分鐘就可以分裂一次，如果不斷迅速地分裂，短時(shí)間內(nèi)可達(dá)驚人的數(shù)目，但實(shí)際上是不可能的。

在培養(yǎng)條件保持穩(wěn)定的狀況下，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液中微生物的菌體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的開始階段，菌體數(shù)目并不增加，一定時(shí)間后，菌體數(shù)目就增長很快，繼而菌體數(shù)目增長速度保持穩(wěn)定，最后增長速度逐漸下降以致等于零。如果以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以單細(xì)胞增長數(shù)目的對(duì)數(shù)值作縱坐標(biāo)，就可作出一條生長曲線。這生長曲線（growthcurve）代表單細(xì)胞微生物從生長開始到衰老死亡的一般規(guī)律。根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growthrateconstant），即每小時(shí)的分裂代數(shù)的不同，一般把典型的生長曲線粗分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)時(shí)期。

（一）

延滯期（lagphase）又叫適應(yīng)期、緩慢期或調(diào)整期，是指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液剛開始的一段時(shí)間細(xì)胞數(shù)目不增加的時(shí)期，甚至細(xì)胞數(shù)目還可能減少。延滯期有如下特點(diǎn)：（1）生長的速率常數(shù)為零。（2）細(xì)胞的體積增大，DNA、含量增多為分裂做準(zhǔn)備。（3）合成代謝旺盛，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。（4）對(duì)不良環(huán)境敏感，例如pH、NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等化學(xué)物質(zhì)。

為了提高生產(chǎn)效率，發(fā)酵工業(yè)中常常要采取措施縮短延滯期，具有十分重要的意義，其方法主要有：（1）以對(duì)數(shù)期的菌體作種子菌，（2）適當(dāng)增大接種量，生產(chǎn)上接種量的多少是影響延滯期的一個(gè)重要因素

，接種量大，延滯期短，接種量小，則延滯期長。一般采用3~8%的接種量，最高不超過1/10。（3）培養(yǎng)基的成分

為了縮短培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分差異，常常在種子培養(yǎng)基中加入生產(chǎn)培養(yǎng)基的某些營養(yǎng)成分，即是種子培養(yǎng)基盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基。（二）對(duì)數(shù)期（logarithmicphase）又叫指數(shù)期，指在生長曲線中，緊接著延滯期后的一段時(shí)期。此時(shí)菌體細(xì)胞生長的速率常數(shù)R最大，分裂快，細(xì)胞每分裂繁殖一次的增代時(shí)間（即代時(shí)，generationtime）短，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，細(xì)胞以驚人的速度產(chǎn)生，群體的形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境的能力強(qiáng)。圖3-12生長曲線中的指數(shù)期

(三)穩(wěn)定期

（stationaryphase）在分批培養(yǎng)中，指數(shù)生長不可能無限制地存在?？梢杂?jì)數(shù)一下，一個(gè)單細(xì)胞細(xì)菌代時(shí)為20分鐘，如果以指數(shù)生長連續(xù)生長48小時(shí)，則生成的群體細(xì)胞重量約是地球的許多倍。這種現(xiàn)象給人印象格外深刻，因?yàn)橐粋€(gè)單細(xì)胞重量約為1×10－12g。顯然，在指數(shù)生長延長到48小時(shí)之前，一定有一些物質(zhì)限制了群體細(xì)胞生長，因此進(jìn)入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期又叫最高生長期或恒定期。處于穩(wěn)定期的微生物其特點(diǎn)是新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡細(xì)胞數(shù)幾乎相等，細(xì)胞數(shù)目沒有凈增加或凈減少，即是正生長與負(fù)生長達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)生長速度逐漸趨向于零。出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因主要有：（1）營養(yǎng)物質(zhì)特別是生長限制因子的耗盡，營養(yǎng)物質(zhì)的比例失調(diào)，例如C/N比值不合適等；（2）酸、醇、毒素或過氧化氫等有害代謝產(chǎn)物的累積；（3）pH、氧化還原勢(shì)等環(huán)境條件越來越不適宜等。在穩(wěn)定期雖然沒有出現(xiàn)生長，但許多細(xì)胞功能包括能量代謝和某些生化合成過程都仍然在繼續(xù)，穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達(dá)到了最高水平，產(chǎn)物的積累也達(dá)到了高峰，這時(shí)，菌體的總產(chǎn)量與所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)之間存在著一定關(guān)系。此外，由于對(duì)穩(wěn)定期到來的原因進(jìn)行研究，促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生和研究。生產(chǎn)上常常通過補(bǔ)料、調(diào)節(jié)溫度和pH等措施，延長穩(wěn)定期，以積累更多的代謝產(chǎn)物。

（四）衰亡期（declinephase或

deathphase）如果群體細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期后仍繼續(xù)培養(yǎng)，這些細(xì)胞或許仍能維持生命和繼續(xù)進(jìn)行代謝，但它們也可能死亡。如果出現(xiàn)死亡，就認(rèn)為群體細(xì)胞處于衰亡期。穩(wěn)定期后，微生物死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負(fù)生長”（R為負(fù)值），此階段叫衰亡期。這時(shí)，細(xì)胞形態(tài)多樣，例如產(chǎn)生很多膨大、不規(guī)則的退化形態(tài)；有的細(xì)胞內(nèi)多液泡，革蘭氏染色反應(yīng)為陽性的變成陰性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增強(qiáng)發(fā)生自溶（autolysis）；有的微生物在這時(shí)產(chǎn)生抗生素等次生代謝產(chǎn)物；對(duì)于芽孢桿菌，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時(shí)期。衰亡期微生物形態(tài)發(fā)生變化酵母菌和霉菌的生長曲線酵母菌的生長曲線：與單細(xì)胞微生物基本相似。絲狀真菌的生長曲線：在液體或深層培養(yǎng)中，以菌絲干重作為衡量的指標(biāo)，菌絲的生長過程分為3個(gè)階段：生長停滯期、迅速生長期、衰亡期，6個(gè)時(shí)期，即停滯期、指數(shù)期、線性期、減速期、穩(wěn)定期、衰亡期。微生物的連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)：菌體培養(yǎng)后，一次性收獲菌體或代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法。我們討論群體生長，在固定體積培養(yǎng)基中出現(xiàn)的微生物生長會(huì)連續(xù)不斷地被生長的微生物體活動(dòng)所改變，直到培養(yǎng)基不再適合它的生長。在分批培養(yǎng)的指數(shù)前期，培養(yǎng)條件或許可以維持相對(duì)穩(wěn)定，但在后期，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目變得非常大的時(shí)候，培養(yǎng)基的化學(xué)組成一般會(huì)發(fā)生巨大的變化。對(duì)許多研究來說，都希望能長時(shí)間地保持培養(yǎng)物處于一種穩(wěn)定的環(huán)境中，這就可以通過使用連續(xù)培養(yǎng)而獲得。連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)又叫開放培養(yǎng)(openculture)，是相對(duì)分批培養(yǎng)(batchculture)或密閉培養(yǎng)(closedculture)而言的。連續(xù)培養(yǎng)是在研究典型生長曲線的基礎(chǔ)上，認(rèn)識(shí)到了穩(wěn)定期到來的原因，采取在培養(yǎng)器中不斷補(bǔ)充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面，及時(shí)不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物（包括菌體和代謝產(chǎn)物）。這樣，培養(yǎng)物就可達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在對(duì)數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率上。連續(xù)培養(yǎng)不僅可隨時(shí)為微生物的研究工作提供一定生理狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)材料，而且可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動(dòng)化水平，此法已成為目前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。第三節(jié)微生物的生長條件及其控制影響微生物生長的外界因素很多，其一是前面討論過的營養(yǎng)物質(zhì)，其二是許多物理、化學(xué)因素。當(dāng)環(huán)境條件的改變，在一定限度內(nèi)，可引起微生物形態(tài)、生理、生長、繁殖等特征的改變；當(dāng)環(huán)境條件的變化超過一定極限時(shí)，則導(dǎo)致微生物的死亡。研究環(huán)境條件與微生物之間的相互關(guān)系，有助于了解微生物在自然界的分布與作用，也可指導(dǎo)人們?cè)谑称芳庸ぶ杏行У乜刂莆⑸锏纳顒?dòng)，保證食品的安全性，延長食品的貨架期。無論是在自然界中，生物體之間存在相互作用，還是在實(shí)驗(yàn)室中純培養(yǎng)的微生物之間的相互作用，環(huán)境因素都能在很大程度上影響它們的生長和代謝產(chǎn)物的能力，這里重點(diǎn)討論其中最主要的溫度、pH、水的有效利用率和氧氣等幾大因素。

生長繁殖，積累發(fā)酵產(chǎn)物環(huán)境微生物生長抑制、變異、死亡食品質(zhì)量控制消毒——是指殺死或消除所有病原微生物的措施，可達(dá)到防止傳染病傳播。防腐——指利用某些理化因子，使物體內(nèi)外的微生物暫時(shí)處于不生長繁殖但又未死亡的方法。常用低溫、干燥、鹽腌、糖漬等方法，或加化學(xué)防腐劑于食品中防止食品腐敗、變質(zhì)。滅菌——是指利用一切物理或化學(xué)因子，使存在于物體內(nèi)所有活的微生物，永久性地喪失其生活力，包括最耐熱的細(xì)菌芽孢，是一種徹底殺菌措施。商業(yè)滅菌——又叫殺菌，是從商品的需要出發(fā)對(duì)食品進(jìn)行的滅菌，它是指食品經(jīng)過殺菌處理后按照一定的檢驗(yàn)方法檢不出活的微生物或僅能檢出極少數(shù)非病原微生物，而且它們?cè)谝欢ǖ谋４嫫趦?nèi)不致引起食品變質(zhì)腐敗。死亡——對(duì)事物來說是不可逆的喪失了生長繁殖能力。

物理因素對(duì)微生物生長的影響一、溫度溫度是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一。在一定溫度范圍內(nèi)，機(jī)體的代謝活動(dòng)與生長繁殖隨著溫度的上升而增加，當(dāng)溫度上升到一定程度，開始對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響，如再繼續(xù)升高，則細(xì)胞功能急劇下降以至死亡。與其他生物一樣，任何微生物的生長溫度盡管有高有低，但總有最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度這三個(gè)重要指標(biāo)，這就是生長溫度的三個(gè)基本點(diǎn)。如果將微生物作為一個(gè)整體來看，它的溫度三基點(diǎn)是極其寬的，由以下可看出：

最低生長溫度（一般為–5~–10℃，極端為–30℃）

嗜冷菌

(15~20℃)生長溫度三基點(diǎn)最適生長溫度

嗜中溫菌

(20~45℃)

嗜熱菌

(45~65℃)

最高生長溫度（一般為80~95℃，極端為105~300℃）

就總體而言，微生物生長的溫度范圍較廣，已知的微生物在零下12~100℃均可生長。而每一種微生物只能在一定的溫度范圍內(nèi)生長。當(dāng)環(huán)境溫度超過微生物生長的最高溫度、或環(huán)境溫度低于微生物生長的最低溫度都會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生殺滅作用或抑制作用圖4-17溫度對(duì)典型的嗜冷生物、嗜溫生物、嗜熱生物及兩種不同的嗜高溫生物的生長速率之間的關(guān)系最低生長溫度

:是指微生物能進(jìn)行繁殖的最低溫度界限。

最適生長溫度:

是指某菌分裂代時(shí)最短或生長速率最高時(shí)的培養(yǎng)溫度。但是，同一微生物，不同的生理生化過程有著不同的最適溫度，也就是說，最適生長溫度并不等于生長量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度，也不等于發(fā)酵速度最高時(shí)的培養(yǎng)溫度或累積代謝產(chǎn)物量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度，更不等于累積某一代謝產(chǎn)物量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度。因此，生產(chǎn)上要根據(jù)微生物不同生理代謝過程溫度的特點(diǎn)，采用分段式變溫培養(yǎng)或發(fā)酵。例如，嗜熱鏈球菌的最適生長溫度為37℃，最適發(fā)酵溫度為47℃，累積產(chǎn)物的最適溫度為37℃。最高生長溫度:

是指微生物生長繁殖的最高溫度界限。在此溫度下，微生物細(xì)胞易于衰老和死亡。微生物所能適應(yīng)的最高生長溫度與其細(xì)胞內(nèi)酶的性質(zhì)有關(guān)。例如細(xì)胞色素氧化酶以及各種脫氫酶的最低破壞溫度常與該菌的最高生長溫度有關(guān)。

致死溫度:

最高生長溫度如進(jìn)一步升高，便可殺死微生物。這種致死微生物的最低溫度界限即為致死溫度。在一定的溫度下處理時(shí)間越長，死亡率越高。嚴(yán)格地說，一般應(yīng)以10分鐘為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間。細(xì)菌在10分鐘被完全殺死的最低溫度稱為致死溫度。

（一）低溫型的微生物

又稱嗜冷微生物，可在較低的溫度下生長。地球表面溫度大多數(shù)相當(dāng)?shù)停Ｑ蟾采w了地球表面的一多半，平均溫度為5℃，開放海洋的深處，恒定溫度在1～3℃。常見的產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬等常使冷藏食品腐敗變質(zhì)。有些肉類上的霉菌在零下10℃仍能生長，如芽枝霉；熒光極毛菌可在零下4℃生長，并造成冷凍食品變質(zhì)腐敗。對(duì)于嗜冷微生物研究要非常小心，這些嗜冷性微生物如果處于室溫下很短一段時(shí)間可能就會(huì)被殺死。因此，在采樣、運(yùn)輸以及實(shí)驗(yàn)室接種、涂布平板等操作過程中防止溫度升高。耐冷微生物比嗜冷微生物分布廣泛得多。可以從溫帶環(huán)境的土壤、水中、肉類、奶類制品及儲(chǔ)藏在冰箱中的蘋果汁、蔬菜中分離到。耐冷性的微生物在20～40℃之間能很好地生長。（二）中溫型的微生物

絕大多數(shù)微生物屬于這一類。最適生長溫度在20—40℃之間，最低生長溫度10—20℃，最高生長溫度45—65℃。它們又可分為嗜室溫和嗜體溫性微生物。嗜體溫性微生物多為人及溫血?jiǎng)游锏牟≡鼈兩L的極限溫度范圍在10—45℃，最適生長溫度與其宿主體溫相近，在35—40℃之間，人體寄生菌為37℃左右。引起人和動(dòng)物疾病的病原微生物、發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用的微生物菌種以及導(dǎo)致食品原料和成品腐敗變質(zhì)的微生物，都屬于這一類群的微生物。因此，它與食品工業(yè)的關(guān)系密切。(三)高溫型微生物

它們適于在45—50℃以上的溫度中生長，在自然界中的分布僅局限于某些地區(qū)，如溫泉、日照充足的土壤表層、堆肥、發(fā)酵飼料等腐爛有機(jī)物中，如堆肥中溫度可達(dá)60—70℃。能在55—70℃中生長的微生物有芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bac.stearothermophilus）高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）等；溫泉中的細(xì)菌；其次是鏈球菌屬和乳桿菌屬。有的可在近于100℃的高溫中生長。這類高溫型的微生物，給罐頭工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)等帶來了一定難度。許多熱泉溫度接近沸點(diǎn)，蒸汽口（熱泉噴氣孔）溫度可達(dá)150～500℃。海洋底部熱水口溫度約達(dá)350℃或更高，但主要集中在美國西部、新西蘭、冰島、日本、地中海地區(qū)、印度尼西亞和法國等地區(qū)。世界上具有最大的熱泉集中區(qū)域面積就是黃石公園－92～93℃（美國）。1、低溫對(duì)微生物的影響：微生物對(duì)低溫具有抵抗力，絕大多數(shù)微生物所處的環(huán)境溫度降低到最低生長溫度時(shí)，微生物的新陳代謝活動(dòng)減弱到最低程度，最后處于停滯或休眠狀態(tài)。這時(shí)微生物的生命活動(dòng)幾乎停止，但能在較長時(shí)間內(nèi)保持生命，少數(shù)要發(fā)生死亡。芽孢、孢子＞球菌＞G+桿菌低溫用于食品的保藏：

寒冷溫度：室溫與冷藏溫度之間，保藏期短，適于果蔬保藏。14—15℃。

冷藏溫度：微生物的生命活動(dòng)顯著降低，但一些嗜冷菌可緩慢生長。適于蔬菜、果品、魚、肉、蛋、乳類短期保藏。0-7℃。

凍藏溫度：0℃以下的溫度，一般凍肉在-18℃保藏，可在較長的時(shí)間內(nèi)保藏食品。-18℃幾乎可以抑制所有微生物的生長。橙子2-9℃香蕉10-11℃葡萄0-1℃檸檬4℃梨–05-1℃芒果6-12℃2、高溫對(duì)微生物的影響：敏感，一般超過微生物的最高生長溫度，敏感的微生物就會(huì)死亡。高溫致死的機(jī)理：菌體蛋白變性，同時(shí)破壞了酶的結(jié)構(gòu)，酶的活性消失了，代謝也就停止了。高溫滅菌的方法：(1)熱（力致）死時(shí)間（ThermalDeathTimeTDT）

是指在特定的條件和特定的溫度下，殺死一定數(shù)量微生物所需要的時(shí)間，稱熱力致死時(shí)間。(2)D值（Decimalreductiontime）

在一定溫度下加熱，活菌數(shù)減少一個(gè)對(duì)數(shù)周期（即90%的活菌被殺死）時(shí)，所需要的時(shí)間（分），即為D值。測(cè)定D值時(shí)的加熱溫度，即在D的右下角表明。例如：含菌數(shù)為105/毫升的菌懸液，在100℃的水浴溫度中，活菌數(shù)降低至104/毫升時(shí)，所需時(shí)間為10分，該菌的D值即為10分，即D100=10分。如果加熱的溫度為121.1℃（250℉），其D常用Dr表示。

(3)Z值

如果在加熱致死曲線中，時(shí)間降低一個(gè)對(duì)數(shù)周期（即縮短90%的加熱時(shí)間）所需要升高的溫度（℃），這所需要升高的溫度數(shù)，即為Z值。

3、高溫滅菌的方法：（1）干熱滅菌法：A火焰滅菌法：特點(diǎn)：速度快、滅菌徹底、效果好。應(yīng)用范圍：廢棄物。B干燥加熱空氣滅菌法：150-160℃，1-2小時(shí)。應(yīng)用范圍：玻璃器皿，金屬及其他干燥耐熱物品的滅菌。玻璃器皿要烘干。（2）濕熱滅菌(moistheatsterilization)（A）煮沸消毒法物品在水中100℃煮沸15分鐘以上，可殺死細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢，如在水中加入1%碳酸鈉或2~5%石炭酸，則效果更好。這種方法適用于注射器、解剖用具等的消毒。（B）巴氏滅菌

(pasteurization)滅菌的溫度一般在60~85℃處理15~30分鐘，可以殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，但不能達(dá)到完全滅菌的目的，用于不適于高溫滅菌的食品，如牛乳、醬腌菜類、果汁、啤酒、果酒和蜂蜜等，其主要目的是殺死