探究Seipin基因與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成脂肪分化的關(guān)系專(zhuān)業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)研究生：陳宏志指導(dǎo)老師：龐麗娟副教授李鋒

教授

2021級(jí)研究生開(kāi)題報(bào)告

匯報(bào)內(nèi)容研究背景研究目的及意義研究?jī)?nèi)容方法和技術(shù)路線主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)已做的準(zhǔn)備工作經(jīng)費(fèi)預(yù)算研究背景人類(lèi)Seipin基因定位于染色體11q13,由Magre等在2001年通過(guò)定位克隆的方法從9個(gè)先天性全身脂肪營(yíng)養(yǎng)不良(CGL)的家系中篩選出來(lái)。Seipin基因的無(wú)義突變與2型CGL密切相關(guān)，該患者缺失幾乎全部的脂肪組織。研究背景：Seipin基因突變的表現(xiàn)Seipin突變?nèi)碇救笔Ъ∪庠龆嗪诩ぐY雄激素過(guò)多肝腫大及脂肪肝食欲亢進(jìn)肌肉中脂質(zhì)沉積主要方面代謝方面生殖方面激素水平其他方面高甘油三酯血癥胰島素抵抗糖尿病瘦素、脂聯(lián)素降低不育HumanMolecularGenetics,2021,Vol.24,No.154238-4249WTSKOWTSKOWTSKO黑色箭頭所指為附睪脂肪墊，顯示SKO動(dòng)物的脂肪缺失；紅色箭頭所指位置為肝臟，顯示SKO動(dòng)物的肝臟增大、顏色發(fā)白，提示脂質(zhì)沉積。JournalofChongqingMedicalUniversity2021.Vol.38No.1兩種動(dòng)物不同放大倍數(shù)下附睪、皮下脂肪形態(tài),與WT動(dòng)物相比，SKO動(dòng)物脂肪細(xì)胞大小、形態(tài)不一，提示SKO動(dòng)物脂肪組織發(fā)育不良。JournalofChongqingMedicalUniversity2021.Vol.38No.1研究背景DiscovMed,2021研究背景干細(xì)胞成骨分化成脂分化骨細(xì)胞脂肪細(xì)胞相互制約seipin研究背景此消彼長(zhǎng)充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞脂肪細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)相關(guān)文獻(xiàn)一時(shí)間作者刊物相關(guān)結(jié)果與結(jié)論2014年LuLiuDiabetesSeipin在維護(hù)脂滴形態(tài)和脂肪細(xì)胞功能中有重要作用。2013年MichelleSimSpringerSeipin基因突變引起脂肪代謝障礙。2012年WeiqinChenMolecularandcellularbiologySeipin基因是終末脂肪分化中激活的脂解作用的自主決定因素。2011年journaloflipidresearchWeihuaFeiSeipin基因突變可以影響脂肪細(xì)胞分化，抑制脂肪形成。2011年XinCuiHumanMolecularGeneticsSeipin基因消除會(huì)引起嚴(yán)重的廣泛的脂肪代謝障礙。2007年SzymanskiPNATLACAD

SCIUSASeipin被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)鏈接中并且對(duì)脂滴形態(tài)的維持起重要作用。相關(guān)文獻(xiàn)二時(shí)間作者刊物相關(guān)結(jié)果與結(jié)論2012年ChenBeiyuCurrentDrugTargets間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力逐漸下降時(shí)，其成骨能力降低，而成脂能力升高。2006年GimbleJMJCellBiochem當(dāng)BMSCs向成脂細(xì)胞方向過(guò)多的分化時(shí),其向成骨方向的分化就會(huì)相應(yīng)的減少,甚至導(dǎo)致成骨缺陷。2006年KrishnanVJournalofClinicalInvestigation體外實(shí)驗(yàn)研究中,培養(yǎng)的干細(xì)胞向成骨分化方向上調(diào)時(shí),其向成脂方向的分化就會(huì)下調(diào),反之亦然。2001年JustesenJBiogerontology在人的骨髓穿刺實(shí)驗(yàn)中證實(shí)：脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間存在著一種“此消彼長(zhǎng)”的關(guān)系。1998年NuttallMEBoneMinerRes脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞具有相同的細(xì)胞表型,在一定的條件下可以相互轉(zhuǎn)化。1992年BeresfordJNJCellSci成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞都來(lái)源于MSC,成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞兩者可以相互轉(zhuǎn)換,并且存在“此消彼長(zhǎng)”的關(guān)系。相關(guān)文獻(xiàn)三時(shí)間作者刊物相關(guān)結(jié)果與結(jié)論2012年JamesAWStemCellsandDevelopment成骨和成脂分化之間存在著反向分化的作用。2008年DavisLACellMolLifeSciWnt經(jīng)典信號(hào)通路在促進(jìn)成骨的同時(shí),可以抑制成脂分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子(C/EBPα、PPARγ等)的表達(dá)和活性,進(jìn)而阻止BMSCs向成脂方向分化。2002年VermaJClinPathol在分化完成后的骨髓脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間同樣可以實(shí)現(xiàn)彼此的相互轉(zhuǎn)換。2001年AhdjoudjSJCellBiochem在骨質(zhì)疏松性骨折病人中發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)的脂肪細(xì)胞與松質(zhì)骨的骨量成反比。1999年WUXBoneMinerRes骨形成蛋白在促進(jìn)MSC向成骨細(xì)胞分化的同時(shí),可抑制其向其它細(xì)胞分化。1998年KellyKAEndocrinology1,25-(0h)2-D3在促進(jìn)MSC向成骨細(xì)胞分化的同時(shí),可抑制其向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

提出問(wèn)題間充質(zhì)干細(xì)胞前脂肪細(xì)胞成熟脂肪細(xì)胞骨細(xì)胞成骨細(xì)胞成脂分化成骨分化課題前期工作1、檢測(cè)Seipin基因敲除鼠的基因型，純合子和野生型分組。2、MicroCT掃描Seipin基因敲除鼠脛骨近端干骺端，記錄整理骨密度、骨小梁寬度。數(shù)據(jù)BMD（骨密度）Tb.Th（骨小梁寬度）天數(shù)純合子野生型純合子野生型300.63426±0.0130.49323±0.0570.07317±0.0090.06734±0.008600.63725±0.0110.60964±0.0650.07295±0.0100.07484±0.002900.63919±0.0280.06329±0.006數(shù)據(jù)

研究目的及意義目的：了解Seipin基因敲除后，小鼠骨量的變化。探究Seipin

基因與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成脂肪分化的關(guān)系。意義：對(duì)于seipin的研究有助于更好地認(rèn)識(shí)脂肪新生、脂滴的

動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以及脂肪代謝與骨代謝之間的關(guān)系，也將為脂

肪營(yíng)養(yǎng)不良和肥胖等代謝性疾病的治療提供新的思路。

研究對(duì)象及內(nèi)容研究對(duì)象：Seipin基因敲除鼠脛骨近端干骺端及長(zhǎng)骨骨髓。研究?jī)?nèi)容：1.小鼠脛骨近端干骺端骨密度、骨小梁寬度。2.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨、成脂肪分化，檢測(cè)并比照純合子、野生型分化情況。

實(shí)驗(yàn)方法1.Seipin基因敲除鼠，采用組織消化法，行DNAPCR擴(kuò)增，

并采用凝膠電泳鑒定小鼠基因型。隨機(jī)選取純合子10只

和野生型10只。30天體重約7g-15g。2.分別在小鼠30天、60天、90天行活體MicroCT掃描，分

析并記錄各時(shí)間點(diǎn)脛骨近端干骺端骨密度和骨小梁寬度。

實(shí)驗(yàn)方法3.取小鼠長(zhǎng)骨骨髓，別離提純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外表抗原Sca-1、CD29、CD11b、CD45進(jìn)行鑒定。4.分別誘導(dǎo)其成骨分化和成脂肪分化，堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色觀察并記錄分化情況。Seipin基因敲除鼠基因型鑒定，分組MicroCT掃描不同時(shí)間點(diǎn)〔30天、60天、90天〕活體小鼠骨密度和骨小梁寬度取小鼠骨髓，別離提純骨髓干細(xì)胞骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化，觀察并記錄分化情況Seipin基因與干細(xì)胞成脂、成骨分化的關(guān)系骨髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化，觀察并記錄分化情況流式檢測(cè)免疫表型技術(shù)路線圖取小鼠骨髓，全骨髓貼壁培養(yǎng)及消化控制法，別離提純骨髓干細(xì)胞骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化，油紅O染色，觀察并記錄分化情況Seipin基因與干細(xì)胞成脂、成骨分化的關(guān)系骨髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化，堿性磷酸酶染色、茜素紅染色，觀察并記錄分化情況流式檢測(cè)免疫表型Sca-1、CD29、CD11b、CD45技術(shù)路線圖

實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作1.查閱相關(guān)文獻(xiàn)，撰寫(xiě)了綜述。2.了解PCR，MicroCT，干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，

流式細(xì)胞檢測(cè)等技術(shù)。

主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)

首次進(jìn)行Seipin基因敲除鼠MicroCT掃描，檢測(cè)Seipin基因敲除后，小鼠骨量的變化。探討Seipin基因與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成脂肪分化的關(guān)系。

可能遇到的困難1.Seipin基