ICS65.020.30CCSB4154西 藏 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB54/T0449—2025PCR2025-05-10發(fā)布 2025-06-10實(shí)施西藏自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB54/T0449DB54/T0449—2025PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語(yǔ)和定義 1縮略語(yǔ) 1儀器和設(shè)備 2試劑和耗材 2樣品采集和處理 2核酸提取 3三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 3結(jié)果判定 3生物安全措施 4附錄A（規(guī)范性） 培養(yǎng)基及溶液配置 5附錄B（規(guī)范性） 陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建 6附錄C（規(guī)范性） 熒光定量引物、Taqman探針名稱及序列 7附錄D（規(guī)范性） 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。都市畜牧總站。紅陽(yáng)、李沛明、張輝、拜占春、韋明邦、李可欣、鐘亞男、石斌。DB54/T0449DB54/T0449—2025PAGEPAGE1藏豬副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌和胸膜肺炎放線桿菌三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了藏豬副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌和胸膜肺炎放線桿菌三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCR生物安全措施等要求。膜肺炎放線桿菌的定性及定量檢測(cè)。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T1948 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則SN/T4835 實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)、利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知模板的定性及定量分析。3.2循環(huán)閾值是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。HPS：副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis）。PM：多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）APP：胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）BHQ1：黑洞淬滅劑-1（BlackHoleQuencher-1）。BHQ2：黑洞淬滅劑-2（BlackHoleQuencher-2）。FAM：一種在熒光定量PCR中常用的熒光探針（FluoresceinAmidite）。CY5：一種在熒光定量PCR中常用的熒光探針（Cyanine5）。VIC：一種在熒光定量PCR中常用的熒光探針（ViewItCompounds）。FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）。NAD：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide）。ROX：一種惰性參比染料（6-Carboxy-X-Rhodamine）。Taqman探針：一種雙標(biāo)記的寡核苷酸水解探針（TaqmanProbe）。TE緩沖液：Tris-EDTA緩沖液（Tris-EDTAbuffer）。TSB：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TrypticaseSoyBroth）。ddH2O：雙蒸水（DoubleDistilledWater）。儀器和設(shè)備熒光定量PCR容量瓶、氣浴恒溫振蕩器等。試劑和耗材除非另有說(shuō)明，在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682的要求。FBS。NADA。A。2×PerfectStart?IIProbeqPCRSuperMixUDG，2×PCR預(yù)混液。50×PassiveReferenceDye，50×ROXEASYDilution（forRealTimePCR，TakaraClontech），PCR的商品化DNA稀釋液。B。ddH2O。DNATaqmanC。0.2mLPCR1.5mL10mL樣品采集和處理采樣工具下列采樣工具適用于本文件。121℃，30min無(wú)菌采樣拭子、采樣管為一次性用品。樣品采集組織樣品用滅菌器械，剪取典型病變的肺部新鮮組織，樣品量≥5g，于無(wú)菌的采樣管中編號(hào)保存。棉拭子樣品將無(wú)菌棉拭子經(jīng)PBS濕潤(rùn)后插入藏豬鼻腔內(nèi)2cm～3cm處，并輕輕旋轉(zhuǎn)3次～5次，折斷后浸泡于盛有2.5mL增菌培養(yǎng)基的一次性搖菌管中。樣品保存與運(yùn)輸上述采集的樣品應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的樣品，在4℃條件下保存不超過(guò)24h，-20℃條件下保存不超過(guò)1個(gè)月，-80℃以下條件保存不超過(guò)6NY/T541樣品處理組織樣品處理取0.5g～1g的組織，將樣品接種到盛有2.5mL增菌培養(yǎng)基的一次性搖菌管中，將搖菌管置于37℃，210r/min，恒溫震蕩培養(yǎng)16h～24h。棉拭子樣品處理吸取7.2.2中混有棉拭子樣品的培養(yǎng)基2.5mL搖菌管置于37℃，210r/min，恒溫震蕩培養(yǎng)16h～24h。核酸提取取7.4中的增菌培養(yǎng)物制備樣品DNADNA提取采用商品化革蘭氏陰性菌DNA組DNA提取試劑盒，具體操作步驟參照所選用的試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系及條件，見(jiàn)附錄D。結(jié)果判定閾值設(shè)定為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)下列質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)適用于本文件。CtCt≤35，擴(kuò)增曲線明顯呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)。檢測(cè)結(jié)果判定需同時(shí)滿足以上兩個(gè)條件，否則本次檢測(cè)無(wú)效。樣品判定下列樣品判定適用于本文件。Ct≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性。CtCt35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣品，判定為可疑，應(yīng)重復(fù)試Ct生物安全措施GB19489NY/T541、NY/T1948、SN/T4835等要求進(jìn)行。附 錄 A（規(guī)范性）培養(yǎng)基及溶液配置NAD貯存液的配制稱取1gNAD溶解于100mLddH2O中，充分搖勻溶解后，用0.22μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾，分裝于無(wú)菌離心管中，置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ鼍囵B(yǎng)液的配制TSB30g，949mLddH2O，加熱至充分溶解后搖勻，121℃15min，4℃條件下保存。50mLFBS1mL1%NAD。附 錄 B（規(guī)范性）HPS由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)參考菌株的infB粒pUC57-infB。PM由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)參考菌株FDAARGOS_218（Genebank：GCA_002073255.2）的kmt1基因保守序列構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-kmt1。APP由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)參考菌株NCTC10976（Genebank：GCF_900638445.1）的apxⅣ基因保守序列構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-apxⅣ。工作濃度陽(yáng)性質(zhì)粒工作濃度為103～105copies/μL。附 錄 C（規(guī)范性）檢測(cè)靶標(biāo)名稱序列HPS檢測(cè)靶標(biāo)名稱序列HPS上游引物5′-AGCTGACGATGGCGTAATG-3′下游引物5′-CACGCTCTAGGTTTGCTTCT-3′Taqman探針5′-FAM-CCATTGAAGCAATCCAACACGCGAAAG-BHQ1-3′PM上游引物5′-TTGTGGCAAAGAAAAGCACAGT-3′下游引物5′-TCAGTTGCGCCGTTGTCA-3′Taqman探針5′-VIC-CACACCAAACTCTGCCCA-BHQ1-3′APP上游引物5′-GGTATCGGTGGAACGGTAAAC-3′下游引物5′-CTTTCGCCGCATTCACTAAAC-3′Taqman探針5′-CY5-CTTAACTTTACCGGCGAGGTGGAAACC-BHQ2-3′DB54/T0449-2025DB54/T0449-2025PAGEPAGE8附 錄 D（規(guī)范性）PCRPCR名稱25μL反應(yīng)體系工作濃度成分12×PerfectStart?IIProbeqPCRSuperMixUDG12.5μL2×成分2HPS引物F0.6μL10μmol/L成分3HPS引物R0.6μL10μmol/L成分4HPSTaqman探針0.7μL10μmol/L成分5PM引物F0.7μL10μmol/L成分6PM引物R0.7μL10μmol/L成分7PMTaqman探針0.7μL10μmol/L成分8APP引物F0.6μL10μmol/L成分9APP引物R0.6μL10μmol/L成分10APPTaqman探針0.6μL10μmol/L成分1150×PassiveReferenceDye參照商品化說(shuō)明書(shū)根據(jù)熒光定量PCR儀選擇成分12TemplateDNA1μL成分13無(wú)菌ddH2Oupto25μLTotal25μL反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；然