分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用

目錄第一節(jié)

基因工程

geneticengineering

重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉不能忘記的人

孟德爾(1822-1884)，“遺傳學(xué)之父”，奧地利原天主教神父

在1865年他根據(jù)豌豆七對不同性狀的雜交實驗，總結(jié)出遺傳因子的概念以及在生殖細(xì)胞成熟中同對因子分離、異對因子自由組合兩條遺傳規(guī)律，也就是人們稱為的孟德爾因子和孟德爾定律。他發(fā)現(xiàn)了遺傳基因原理，總結(jié)出分離規(guī)律和自由組合規(guī)律，為遺傳學(xué)提供了數(shù)學(xué)基礎(chǔ)，創(chuàng)立了孟德爾學(xué)派。

不能忘記的人

摩爾根（ThomasHuntMorgan）（1866―1945年）美國遺傳學(xué)家

不能忘記的人

從1910年到30年代托馬斯·亨特·摩爾根及其助手在果蠅遺傳實驗中，進(jìn)一步證實了孟德爾因子的存在，證實了孟德爾已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過的遺傳的分離定律和自由組合定律，而且還作出了另外兩大重要發(fā)現(xiàn)：一是發(fā)現(xiàn)基因是在染色體上，二是發(fā)現(xiàn)了遺傳的基因連鎖和互換定律。在果蠅遺傳實驗的基礎(chǔ)上，摩爾根還建立了作為摩爾根理論主要基礎(chǔ)的基因?qū)W說。

“實驗方法的本質(zhì)在于要求每一種見解或假說都必須通過實驗的檢驗，然后才得以承認(rèn)其科學(xué)地位?！薄柛?/p>

不能忘記的人沃森（JamesDeweyWatson）和克里克（FrancisHarryComptonCrick）

1953年4月25日，英國《自然》雜志發(fā)表了沃森和克里克的文章“核酸的分子結(jié)構(gòu)——脫氧核糖核酸的一個結(jié)構(gòu)模型”。標(biāo)志著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的建立，從此，遺傳學(xué)的歷史和生物學(xué)的歷史都從細(xì)胞階段進(jìn)入了分子階段。

桑格（FrederickSanger）、吉爾伯特（WalterGilbert）

桑格（英國化學(xué)家）由于最早準(zhǔn)確地測定了胰島素51個氨基酸的序列而獲得1958年的諾貝爾化學(xué)獎。22年后，他又因測定了一種噬菌體的DNA一級結(jié)構(gòu)而獲1980年的諾貝爾化學(xué)獎。在DNA測序領(lǐng)域，吉爾伯特也因其卓越的工作獲得80年的諾貝爾化學(xué)獎，共同為推進(jìn)生命科學(xué)的進(jìn)步作出了貢獻(xiàn)。

伯格（美國生物化學(xué)家）通過把兩個不同來源的DNA連接在一起并發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)功能，證明了完全可以在體外對基因進(jìn)行操作。他作為“重組DNA技術(shù)之父”，于1980年獲諾貝爾化學(xué)獎。1973年，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科恩等人和博耶等人將大腸桿菌中兩種不同特性的質(zhì)粒片段用內(nèi)切酶和連接酶進(jìn)行剪切和拼接，獲得了第一個重組質(zhì)粒，然后通過轉(zhuǎn)化技術(shù)將它引入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，并發(fā)現(xiàn)它能表達(dá)原先兩個親本質(zhì)粒的遺傳信息，從而開創(chuàng)了遺傳工程的新紀(jì)元。伯格（PaulBerg）、科恩、H·博耶

不能忘記的人穆利斯（KaryB.Mullis）

1985年穆利斯發(fā)明了高效復(fù)制DNA片段的“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)”技術(shù)，利用該技術(shù)可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子，使基因工程獲得了革命性發(fā)展?！皩嶒灴茖W(xué)，與人們習(xí)慣的其他事物都不同，像一株野草，在我們不經(jīng)意間成長著。這株野草一年四季都能結(jié)出許多耀眼的真理和奇妙的機(jī)器。藝術(shù)囿于奇想和時尚。宗教著重內(nèi)心而僅能自持。法律忽而放縱我們，忽而使我們淪為奴隸。惟有實驗科學(xué)，才以一種不可預(yù)見但有規(guī)律的方式給我們每個人送來果實。為了獲取這些果實，舊時的帝王定會不惜兵戎相見”。——穆利斯相關(guān)概念工具酶載體基本原理基本過程基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用本節(jié)主要內(nèi)容一、基因工程的基本概念（一）DNA重組(DNArecombination)不同來源的DNA分子可以通過末端共價連接（磷酸二酯鍵）而形成重新組合的DNA分子，這一過程稱為DNA重組。DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。基因克隆示意圖（二）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）（三）生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補平3′末端逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記堿性磷酸酶切除末端磷酸基末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾二、常用的工具酶：（一）限制性核酸內(nèi)切酶1.定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ一把特殊的剪刀

—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）作用：限制-修飾系統(tǒng)第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。2.命名Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilus

influenzae

d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶3.Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

4.Ⅱ類酶的切割位點

：出現(xiàn)兩種末端粘性末端粘端（5’突出、3’突出）平頭末端平端

GGATCCCCTAGG4~6bp粘性末端與平頭末端

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

5’-G5’-AATTC-3’3’-CTTAA-5’G-5’Sticky

ends（1）5’突出粘性末端

ApaI5’-GGGCCC-3’3’-CCCGGG-5’

5’-GGGCC-3’C-3’3’-C3’-CCGGG-5’（2）3’末端突出的粘性末端

EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’（3）平頭末端（鈍性末端）1、DNA連接酶大腸桿菌的DNA連接酶T4噬菌體的DNA連接酶（二）其它工具酶2.DNA聚合酶（1）種類及性質(zhì)主要有：大腸桿菌DNA聚合酶IT4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶①要求有DNA單鏈為模板和3’-OH的引物鏈②具有5’3’聚合活性、5’3’外切酶活性、和3’5’外切酶活性③要求DNA底物具有5’-磷酸和3’-羥基共同特性：（2）主要用途合成ds-cDNA第二條鏈對DNA的3’端進(jìn)行填補或末端標(biāo)記E.coli

DNA聚合酶I用于缺口平移，制作DNA標(biāo)記探針DNA聚合酶I和T4DNA聚合酶用于DNA序列測定TaqDNA聚合酶用于PCR3.逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA模板、引物、dNTPs）主要用途：①構(gòu)建cDNA文庫②填補和標(biāo)記3’端制備DNA探針③DNA序列測定4、多聚核苷酸激酶5’-HOOH-5’5’-PP-5’ATP(γ-P)或RNAP-5’DNA用途：①放射性標(biāo)記DNA鏈的5’端②使缺少5’-磷酸基的DNA磷酸化，用于連接反應(yīng)。5、堿性磷酸酶5’-PP-5’5’-HOOH-5’用于防止載體的自身連接6、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶3’5’NNNNNNN5’dNTP為底物ssDNA或dsDNA為模板5’3’5’NNNNNNN三、載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA粘粒DNA病毒DNA載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制，并有較高的拷貝數(shù)；容易進(jìn)入宿主細(xì)胞；常具有多個RE的單一酶切位點，稱為多克隆位點（外源DNA插入點）；容易從宿主細(xì)胞中分離純化；有容易被識別篩選定標(biāo)志。載體的結(jié)構(gòu)特點復(fù)制起始點單一的限制酶切割位點選擇標(biāo)記三個基本要素（一）質(zhì)粒

(plasmid)特點能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。一般大小在2~300kb。＜15kb的易分離純化一般容納＜10kb外源DNA目錄pUC系列的特點pBR322的ampr的抗性基因和復(fù)制起始點(ori)E.coli的Lac操縱子的LacI、LacP、

LacO及

LacZ’基因片段，在LacZ’

基因中加入了多克隆位點?；パalacZ基因編碼大腸桿菌的－半乳糖苷酶，此酶是乳糖分解過程的重要酶，同時可作用于生色底物X－gal，產(chǎn)生藍(lán)色化合物。載體中的lacZ’基因編碼此酶的N端片段，稱片段。與之相應(yīng)，采用的受體大腸桿菌lacZ基因缺陷，只能產(chǎn)生酶的C端片段，稱片段。當(dāng)片段與片段共同存在時具有－半乳糖苷酶活性，而單獨存在時無活性。λ噬菌體基因組：約50kb的線性雙鏈DNA分子

cos末端：互補的單鏈末端2種繁殖方式：溶菌性；溶原性（二）噬菌體(phage)

（三）粘性質(zhì)粒(cosmid)－粘粒由λ噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒組合的裝配型載體酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，猴空泡病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（四）病毒及其他四、重組DNA技術(shù)的基本原理克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA重組技術(shù)（分子克隆技術(shù)、基因工程技術(shù)）

是指采用分子生物學(xué)的方法分離目的基因片段，進(jìn)行剪切和組合等處理后，與適當(dāng)?shù)妮d體DNA分子進(jìn)行重組，然后將重組體分子引入特定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行大量復(fù)制和表達(dá)的一整套實驗技術(shù)。五、重組DNA技術(shù)的基本過程基本步驟：制備目的基因和相關(guān)載體將目的基因與載體連接將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞DNA重組體的篩選和鑒定DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其它研究以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程目錄（一）目的基因的制備1.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)2.制備cDNA文庫(cDNAlibrary)3.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)4.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。

組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列（二）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。2.同聚物加尾連接末端轉(zhuǎn)移酶AAAAAAAATTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTT3.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（三）將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（四）目的基因的篩選和鑒定

1.遺傳學(xué)方法2.分子雜交方法3.免疫學(xué)方法(插入失活法)抗藥