目錄TOC\o"1-4"\h\u29222摘要 摘要為篩選高效纖維素降解菌。本研究采用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）平板法從黔金絲猴糞便中篩選出一株（QJ-1）纖維素降解菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16SrDNA分析，該菌為（Bacillus）芽孢桿菌屬，可推測(cè)為Bacillusmegaterium（巨大芽孢桿菌）。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QJ-1最佳產(chǎn)酶條件為接種量為5.21%、溫度為64.11℃、pH值為6.01、培養(yǎng)時(shí)間為85.55h。此外，QJ-1具有較好的纖維素酶生產(chǎn)能力和較強(qiáng)的耐高溫潛力，在農(nóng)作物秸稈降解方面具有一定的應(yīng)用潛力。關(guān)鍵詞：黔金絲猴；纖維素降解菌；QJ-1；巨大芽孢桿菌；產(chǎn)酶條件優(yōu)化AbstractToscreenforefficientcellulosedegradingbacteria.Thisstudyusedcarboxymethylcellulosesodium(CMCNa)platemethodtoscreenacellulosedegradingbacterium(QJ-1)fromthefecesofGuizhougoldenmonkeys.Throughmorphologicalobservationand16SrDNAanalysis,itwasfoundthatthebacteriumbelongstothegenusBacillus,whichcanbeinferredasBacillusmegaterium.Throughsinglefactorandresponsesurfaceexperiments,itwasfoundthattheoptimalenzymeproductionconditionsforQJ-1were5.21%inoculationamount,64.11℃temperature,pHvalueof6.01,andcultivationtimeof85.55hours.Inaddition,QJ-1hasgoodcellulaseproductioncapacityandstronghigh-temperatureresistancepotential,andhascertainapplicationpotentialinthedegradationofcropstrawKeywords:Guizhougoldenmonkey(Rhinopithecusbrelichi);Cellulosedegradingbacteria;QJ-1;Bacillusmegaterium;Optimizationofenzymeproductionconditions引言我國(guó)是世界上最大的農(nóng)業(yè)國(guó)家,作物秸稈資源非常豐富REF_Ref3417\r\h[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年生產(chǎn)8.65億噸秸稈，占世界秸稈總產(chǎn)量的20-30%REF_Ref4008\r\h[2]。然而，大量的作物秸稈被簡(jiǎn)單填埋和焚燒處理，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境REF_Ref4145\r\h[3]。秸稈主要由有機(jī)物和無(wú)機(jī)物構(gòu)成，無(wú)機(jī)物主要為灰分，有機(jī)物包含纖維素、木質(zhì)素和半纖維素等REF_Ref6017\r\h[4]，其中纖維素含量占比約45%REF_Ref6115\r\h[5]。纖維素是固體作物發(fā)酵的主要底物REF_Ref4050\r\h[6,REF_Ref4063\r\h7]，主要用于動(dòng)物飼料、造紙、紡織和食品工業(yè)REF_Ref6467\r\h[8]。纖維素在植物細(xì)胞中以多聚糖的形式存在，由于其具有不溶于水的緊密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此不容易水解成可用的葡萄糖REF_Ref6559\r\h[9]，導(dǎo)致利用率非常低。纖維素的降解是秸稈開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵REF_Ref6673\r\h[10]。纖維素生物降解法是一種利用微生物(如細(xì)菌和真菌)產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)降解纖維素并回收資源的方法REF_Ref6745\r\h[11]。它具有反應(yīng)條件溫和、效率高、能耗低、成本低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種高效的纖維素降解方法REF_Ref6885\r\h[12]。因此，篩選和探索高效的纖維素降解菌有望為生物降解提供更高效的菌種資源。目前，人們從多種動(dòng)物中分離出多種纖維素降解菌，例如Azizi等REF_Ref6993\r\h[13]從白蟻腸道中分離出一種纖維素降解菌，可以改變小麥草和棗樹(shù)葉的部分化學(xué)成分，并提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率。Harsini等REF_Ref6973\r\h[14]從馬胃中分離出4株纖維素降解菌，他們可改變小麥秸稈的化學(xué)成分，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。李國(guó)偉等REF_Ref7261\r\h[15]從雙峰駝中篩選出一株纖維素降解菌YT5-1-1，該菌對(duì)酒糟中的半纖維素和纖維素降解率比空白組分別提高了4.18%和3.46%。龐美玲等REF_Ref7346\r\h[16]從黑葉猴腸道內(nèi)分離出一株纖維素降解菌GXNQ-1，將其作為飼料添加劑飼養(yǎng)雞群可促進(jìn)其代謝效率、加快體重增加。黔金絲猴(Rhinopithecusbrelichi)主要以樹(shù)葉為食，屬國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物REF_Ref7447\r\h[17]。基于16SrRNA高通量分析發(fā)現(xiàn)其腸道中存在多種纖維素降解菌群REF_Ref7708\r\h[18]。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黔金絲猴腸道纖維素降解菌的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在從黔金絲猴糞便中分離篩選纖維素降解菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，為該菌的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考及豐富纖維素降解菌群資源庫(kù)。材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)材料的收集新鮮糞便樣本采集自貴州省梵凈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局野生動(dòng)物救助中心的黔金絲猴。清晨將新鮮糞便收集到無(wú)菌袋后立即干冰冷凍并帶回實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于-80°C待用。1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器主要實(shí)驗(yàn)儀器相關(guān)信息見(jiàn)表1。表1主要實(shí)驗(yàn)儀器相關(guān)信息Tab.1Informationaboutmainexperimentalinstruments儀器名稱生產(chǎn)廠家型號(hào)高壓蒸汽滅菌鍋致微廈門儀器有限公司GR85DA超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司SW-CJ-2FD恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠BMJ-250C恒溫水浴鍋上海一恒科學(xué)儀器有限公司DK-8D電子天平上海英衡電子秤有限公司YHB-1003恒溫震蕩培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司HZQ-211C紫外分光光度計(jì)上海儀電分析儀器有限公司722N1.1.3培養(yǎng)基與試劑表2培養(yǎng)基配置方法Tab.1Culturemediumconfigurationmethod培養(yǎng)基或試劑配置方法富集培養(yǎng)基CMC-Na1.0g、酵母粉1.0g、(NH4)2SO41.0g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.1g、蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2初篩培養(yǎng)基CMC-Na5.0g、(NH4)2SO41g、KH2PO41.0g、MgSO40.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.1g、瓊脂15.0g、剛果紅0.2g、蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2復(fù)篩培養(yǎng)基CMC-Na2g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，MgSO4·7H2O0.25g，(NH4)2SO40.25g，Na2HPO40.05g，KH2PO40.5g，剛果紅0.2g，蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2發(fā)酵培養(yǎng)基CMC-Na5.0g、(NH4)2SO41.4g，MgSO4·7H2O0.3g、KH2PO42.0g、CaCl20.3g、FeSO4·7H2O0.005g、MnSO40.0016g、ZnSO4·7H2O0.0014g、CoCl20.002g、蛋白胨5.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2LB培養(yǎng)基CMC-Na15.0g，NH4NO31.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，NaCl1.0g，蛋白胨1.0g，酵母提取物1.0g，瓊脂20g，蒸餾水1.0L，pH7.0～7.2檸檬酸緩沖液檸檬酸21.014g溶解后定容1000mL后取230mL；檸檬酸鈉29.41g溶解后定容1000mL后取270mL，將兩者混合，定容至500mL1.2方法1.2.1纖維素降解菌篩選1.2.1.1纖維素降解菌的富集及初篩將冷凍的黔金絲猴糞便放在超凈操作臺(tái)桌面中去除表面污染物后，從內(nèi)部準(zhǔn)確稱取1.0g，將其放入裝有玻璃珠（0.5mm）的9mL富集培養(yǎng)基內(nèi)。37℃，180r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后按照10倍稀釋法制備1×10-1～10-9系列稀釋梯度，并將最后三個(gè)稀釋梯度的樣液各吸取90μL涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)72小時(shí)，篩選出長(zhǎng)有菌落的平板。1.2.1.2纖維素降解菌的復(fù)篩將初篩得到的菌株涂布在復(fù)篩培養(yǎng)基上，利用剛果紅法篩選纖維素降解菌，單菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈，則可證明該菌具有纖維素酶活力。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落透明圈直徑（D，mm）與菌落直徑（d，mm）。根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值大小和水解圈清晰程度確定最優(yōu)菌株REF_Ref7871\r\h[19]。再將復(fù)篩出的最優(yōu)菌株在纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線分離，獲得較純的單菌落，甘油保種。本研究確定一株生長(zhǎng)良好，具有纖維素酶生產(chǎn)能力的菌，并將其命名為QJ-1。1.2.2纖維素內(nèi)切酶（CMCase）活力測(cè)定使用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定水解過(guò)程中釋放的還原糖量，從而確定纖維素的CMC-ase酶活性。在檸檬酸鹽緩沖液（pH5.0）中制備1%CMC溶液，并用作底物。將0.5mL粗酶溶液加入到1.5mLCMC-Na中?；旌衔镌?0℃下孵育30分鐘。然后加入3,5-二硝基水楊酸（1.5mL）以終止反應(yīng)。將處理過(guò)的樣品煮沸10分鐘，在水中冷卻以穩(wěn)定顏色，搖勻，再利用分光光度計(jì)在540nm條件下測(cè)定吸光度值。使用葡萄糖作為校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)估計(jì)還原糖從反應(yīng)混合物中的釋放（y=0.3758x+0.0058；R2=0.9992）。酶活定義：在50℃反應(yīng)條件下，1min內(nèi)催化底物生成1μmol葡萄糖所需要的纖維素酶的量，用1U/mL表示REF_Ref7950\r\h[20]。1.2.3菌株的形態(tài)學(xué)觀察在37℃下將QJ-1菌株在纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72小時(shí)后觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察并記錄細(xì)菌的形態(tài)和染色特征。1.2.4分子生物學(xué)鑒定1.2.4.1菌株基因組DNA提取將QJ-1菌株進(jìn)行活化，使用SK8255Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.2.4.2菌株P(guān)CR擴(kuò)增利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增。以上鑒定在生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如表所示:表3細(xì)菌PCR反應(yīng)體系Tab.3bacterialPCRreactionsystemPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體積（uL）PremixTaq1.5引物27F0.5引物1492R0.5DNA模板0.5ddH2O19.5緩沖液(10XBuffer)2.5dNTPs1總體積25uL表4PCR擴(kuò)增程序Tab4PCRamplificationprocedure步驟溫度（℃）時(shí)間（min）循環(huán)預(yù)變性94432變性940.75退火550.75延伸721繼續(xù)延伸7210保溫4∞1.2.4.3PCR擴(kuò)增序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入NCBI中進(jìn)行Blast同源比對(duì)，下載相似性較大的基因序列，利用Mega7.1軟件中的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建菌株QJ-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。1.2.5單因素試驗(yàn)1.2.5.1接種量?jī)?yōu)化將解凍的菌液接種于LB液體培養(yǎng)基制成種子液，以發(fā)酵培養(yǎng)基50ml的1%、2%、3%、4%、5%、6%吸取至三角瓶中，調(diào)節(jié)初始pH至7并在37℃、180r/min條件下培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定CMC-ase活力。1.2.5.2溫度優(yōu)化以發(fā)酵培養(yǎng)基的5%吸取至三角瓶中，調(diào)節(jié)初pH至7，分別在溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的條件下，180r/min恒溫震蕩培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定CMC-ase活力。1.2.5.3初始pH優(yōu)化以發(fā)酵培養(yǎng)基的5%吸取至三角瓶中，將pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，在60℃、180r/min恒溫震蕩培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定CMC-ase活力。1.2.5.4發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化按發(fā)酵培養(yǎng)基50ml的5%的接種量，接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，調(diào)節(jié)初始pH為6，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中60℃、180r?min-1培養(yǎng)60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)和96小時(shí)，測(cè)定CMC-ase活力。1.2.6響應(yīng)面方法優(yōu)化纖維素酶生產(chǎn)根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化后的結(jié)果，以最適發(fā)酵條件為中心點(diǎn)，應(yīng)用Design-Expert12.0軟件中的Box–Benhnken模型設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，以CMC-ase酶活力為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、初始pH值（C）和接種量（D）四個(gè)影響因素進(jìn)一步優(yōu)化，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平如表5所示。顯著性水平為0.05的F檢驗(yàn)、決定系數(shù)（R2）和擬合缺失用于測(cè)量二階多項(xiàng)式模型的擬合優(yōu)度。使用Design-Expert12.0軟件中的響應(yīng)面方法等高線表面程序來(lái)獲得擬合的等高線圖。表5響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Tab.5Responsesurfacetestfactorsandlevels因素水平-101A溫度/℃556065B接種量/％456C時(shí)間/h788490D初始pH567結(jié)果與分析2.1纖維素降解菌的篩選本研究通過(guò)稀釋涂布、分離純化，得到的4株纖維素降解菌，透明圈直徑（D，mm）與菌落直徑（d，mm）比（D/d）如表6所示，將兩者比值最大的菌株進(jìn)行純化并將其編號(hào)為QJ-1。表6剛果紅水解圈Tab.6Congoredhydrolysiscycle菌株（QJ-1）菌落直徑（d）/mm水解圈（D）/mm比值117.338.102.14219.118.502.25317.207.702.23420.009.462.112.2纖維素降解菌形態(tài)學(xué)觀察形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，篩選得到的QJ-1菌落邊緣不整齊，表面凸起，扁平、光滑無(wú)褶皺，透明圈較大，也反映了該菌株具有很強(qiáng)的纖維素降解能力（圖1）。光學(xué)顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)呈桿狀，有芽孢，染色鑒定為革蘭陽(yáng)性菌（圖2）圖1QJ-1菌株的剛果紅染色圖2菌株QJ-1的革蘭氏染色結(jié)果（1000×)Fig.1CongoredstainingofQJ-1strainFig.2Gram-stainedresultsofstrainQJ-1（1000×)2.3分子生物學(xué)鑒定QJ-1的PCR擴(kuò)增目的條帶為單條帶，片段長(zhǎng)度約為1488bp(圖3)。將QJ-1測(cè)序結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與部分芽孢桿菌屬物種具有99%以上的序列相似性。如圖4顯示，該菌株與H1巨大芽孢桿菌（GenBank登錄號(hào):NRON259624.1）的16SrDNA序列相似性100%一致。因此推測(cè)分離得到的菌株為巨大芽孢桿菌。注：M為Marker;QJ-1為樣品圖316SrDNA擴(kuò)增結(jié)果圖4QJ-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.316SrDNAamplificationresultsFig.4Phylogenetictree2.4單因素產(chǎn)酶條件優(yōu)化從圖5可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)CMC-ase酶活性最大，在pH6時(shí)觀察到最高的CMCase活性。當(dāng)溫度為60℃時(shí)CMC-ase酶活性最大。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為84h時(shí)，觀察到最高的CMCase活性，因此，可選擇接種量為5%、pH6、溫度為60℃、發(fā)酵時(shí)間為84h作為菌株QJ-1產(chǎn)酶的最適發(fā)酵條件。圖5不同產(chǎn)酶條件下菌株QJ-1的產(chǎn)酶活力Fig.5EnzymesactivitiesproducedbystrainQJ-1underdifferentenzymeproductionconditions2.5響應(yīng)面試驗(yàn)2.5.1響應(yīng)面模型的構(gòu)建及方差分析根據(jù)表5設(shè)計(jì)的因素和水平編碼表，以發(fā)酵溫度（A）、時(shí)間（B）、初始pH（C）和接種量（D）為自變量，以CMC-ase酶活為響應(yīng)值，使用Design-Expert12.0軟件中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)29組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行在多元回歸方程擬合后所得到的二次回歸方程預(yù)測(cè)模型如下：Y(CMCase)=2.09+0.0889A+0.0099B+0.0243C+0.0230D+0.2058AB+0.0943AC+0.1663AD-0.2067BC-0.1627BD-0.3020CD-0.4880A2-0.5537B2-0.5696C2-0.3273D2對(duì)所得到的回歸方程預(yù)測(cè)模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表8。模型P值為0.0005(p<0.05)，達(dá)到極顯著水平，模型的失擬項(xiàng)P值為0.67(p>0.05)，表現(xiàn)為不顯著。表明此預(yù)測(cè)模型擬合度高，能夠很好的預(yù)測(cè)分析QJ-1發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。此外，根據(jù)表8中各個(gè)因素的F值和P值的大小可以確定它們對(duì)QJ-1產(chǎn)纖維素酶活性的影響順序?yàn)锳（發(fā)酵溫度）>C（初始pH）>D（接種量）>B（發(fā)酵時(shí)間）。表7響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Tab.7Experimentaldesignandresultanalysisofresponsesurface序號(hào)A(℃)發(fā)酵溫度B(h)時(shí)間CpHD(%)接種量CMCase(U/ml)酶活性(單位/毫升)16072751.25926084760.67636584751.31446596651.40955584641.03266084741.48576096641.40786096750.74196084541.042106572650.726116584661.860125584751.065136072661.40145584661.157156584550.875166072641.189176072550.789186084652.271196584551.003206084651.899216084652.323226584641.070236096660.967246084651.736255596650.895266096551.098276084561.441285572651.035296084652.229表8回歸模型方差分析Tab.8varianceAnalysisofregressionmodel變異源Variancesource平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareF值FvalueP值Pvalue顯著性SignificanceModel200.601414.336.750.0005**A-發(fā)酵溫度3.6413.641.710.2115B-發(fā)酵時(shí)間0.044410.04440.02090.8871C-初始pH0.267010.26700.12570.7282D-接種量0.243710.24370.11470.7399AB6.4816.483.050.1027AC1.3611.360.63900.4374AD4.2214.221.990.1804BC6.5316.533.070.1014BD4.0614.061.910.1885CD13.95113.956.570.0226*A259.05159.0527.800.0001**B275.96175.9635.76<0.0001**C280.47180.4737.88<0.0001**D226.52126.5212.490.0033*Residual29.74142.12Lackoffit19.48101.950.75990.6700PureError10.2642.56CorTotal230.3428*差異顯著（p<0.05）**差異非常顯著（p<0.01）2.5.2變量交互作用的顯著程度響應(yīng)面曲線圖可以直觀的反映出任意兩個(gè)變量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)表7繪制響應(yīng)面曲線圖（圖6-11）以進(jìn)一步分析篩選QJ-1最優(yōu)發(fā)酵條件。結(jié)合曲面的傾斜程度以及方差分析結(jié)果可以看出，pH與接種量之間的交互作用對(duì)酶活影響顯著(p<0.05)，而溫度與接種量、溫度與pH之間的交互作用對(duì)酶活性的影響不顯著(p>0.05)。圖6發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性等值線和響應(yīng)面的影響Fig6.Theimpactofculturetemperatureandfermentationtimeontheenzymeactivitycontourandresponsesurface圖7初始pH和發(fā)酵溫度對(duì)酶活性等值線和響應(yīng)面的影響Fig.7TheimpactofinitialpHandculturetemperatureontheenzymeactivitycontourandresponsesurface圖8接種量和發(fā)酵溫度對(duì)酶活性等值線和響應(yīng)面的影響Fig.8Theimpactofinoculumconcentrationandculturetemperatureontheenzymeactivitycontourandresponsesurface.圖9初始pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性等值線和響應(yīng)面的影響Fig.9TheimpactofinitialpHandfermentationtimeontheenzymeactivitycontourandresponsesurface.圖10接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性等值線和響應(yīng)面的影響Fig.10Theimpactofinoculumconcentrationandfermentationtimeontheenzymeactivitycontourandresponsesurface.圖11接種量和初始pH對(duì)酶活性等值線和響應(yīng)面的影響Fig.11TheimpactofinoculumconcentrationandinitialpHontheenzymeactivitycontourandresponsesurface2.5.3QJ-1菌株的最佳發(fā)酵條件的確定Design-Expert12.0軟件分析，發(fā)現(xiàn)QJ-1最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度64.11℃、接種量5.21%、時(shí)間85.55h和pH6.01，在此條件下培養(yǎng)QJ-1，可以得到最大纖維素酶活的預(yù)測(cè)值為2.323U/ml。考慮到實(shí)際操作的條件，將最優(yōu)發(fā)酵條件調(diào)整為：溫度64℃、接種量5%、時(shí)間85h和pH6.0。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得纖維素酶活實(shí)際值為2.517U/ml。實(shí)際值和預(yù)測(cè)值相差很小，說(shuō)明該預(yù)測(cè)模型擬合度高，并且準(zhǔn)確可靠。討論纖維素酶的產(chǎn)生主要來(lái)源于真菌和細(xì)菌REF_Ref8074\r\h[21]，許多真菌，如長(zhǎng)枝木霉REF_Ref8152\r\h[22]、桔青霉REF_Ref8263\r\h[23]和煙曲霉REF_Ref8476\r\h[24]等，具有強(qiáng)大的纖維素降解能力。相比之下，細(xì)菌具有纖維素酶活性高的特點(diǎn)，并且繁殖周期短、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)REF_Ref8593\r\h[25]，在降解纖維素農(nóng)業(yè)廢棄物方面具有一定應(yīng)用潛力。因此，人們一直在探索高效纖維素降解細(xì)菌。剛果紅染色法是一種基于剛果紅與纖維素結(jié)合形成紅色復(fù)合物的原理，在培養(yǎng)基中形成以纖維素降解細(xì)菌為中心的透明圈REF_Ref8658\r\h[26]。由于該方法操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確，因此被廣泛認(rèn)為是初步篩選纖維素降解菌菌的最佳方法REF_Ref8714\r\h[27]。菌株的纖維素降解能力取決于纖維素酶活性，而接種量、溫度、發(fā)酵時(shí)間和pH等因素均會(huì)影響纖維素酶活性REF_Ref8933\r\h[28,REF_Ref8939\r\h29,REF_Ref8949\r\h30]。因此，優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件對(duì)于有效利用菌種具有重要意義。響應(yīng)面法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、實(shí)驗(yàn)周期短、回歸方程精度高、預(yù)測(cè)性能好等優(yōu)點(diǎn)，在微生物發(fā)酵優(yōu)化中得到廣泛應(yīng)用。例如，Akhir等REF_Ref9207\r\h[31]利用響應(yīng)面法對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，不僅酶活提高了5.4倍，而且減少了培養(yǎng)基用量。Dan等REF_Ref7871\r\h[19]使用響應(yīng)面法優(yōu)化蠟狀芽孢桿菌甘露聚糖酶的生產(chǎn)，優(yōu)化后的產(chǎn)酶量提高了1.4倍。單建榮等人REF_Ref9498\r\h[32]利用響應(yīng)面優(yōu)化牛糞堆肥，纖維素酶活提高了1.6倍提高了1.3倍。本研究發(fā)現(xiàn)QJ-1經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件后，在接種量為5.21%、溫度為64.11、pH值為6.01、培養(yǎng)時(shí)間為85.55h時(shí)產(chǎn)纖維素達(dá)到最大，酶活提高了1.6倍。目前，國(guó)內(nèi)外已篩選到多種耐高溫的纖維降解菌并開(kāi)展了較為系統(tǒng)的研究，例如，YeM等REF_Ref9671\r\h[34]從鵝盲腸篩選出1株解淀粉芽孢桿菌S1，其能在37℃下纖維素酶活0.68U/mL。李雅靜等REF_Ref9801\r\h[34]從蒙古馬盲腸內(nèi)容物中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌H-3，在65℃、pH值4.8條件下纖維素酶活力達(dá)到0.60U/mL。陳龍等REF_Ref9922\r\h[35]從梅花鹿糞便篩選出甲枯草芽孢桿菌Lu14，50℃高溫下其纖維素酶活1.105U/mL。本研究篩選出一株纖維素降解菌QJ-1，在60℃高溫下纖維素酶活達(dá)到2.517U/mL，具有較好的熱穩(wěn)定性和較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，但關(guān)于該菌株在農(nóng)作物秸稈降解應(yīng)用的效果有待進(jìn)一步研究。結(jié)論本研究從黔金絲猴糞便中篩選并鑒定出一株可有效降解纖維素的Bacillus（芽孢桿菌屬），推測(cè)菌株為巨大芽孢桿菌。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法得到的QJ-1最佳產(chǎn)酶條件為:接種量為5.21%，溫度為64.11℃，pH值為6.01，培養(yǎng)時(shí)間為85.55h。該菌株具有良好的熱穩(wěn)定性，可應(yīng)用于較高溫度下的農(nóng)作物發(fā)酵，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。參考文獻(xiàn)張榮成,李秀金.作物秸稈能源轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工,2005,(06):14-17.石祖梁,賈濤,王亞靜,等.我國(guó)農(nóng)作物秸稈綜合利用現(xiàn)狀及焚燒碳排放估算[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃,2017,38(09):32-37.金偉,陳文靜,姚斌,等.一株產(chǎn)纖維素酶的耐熱煙曲霉篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].中國(guó)釀造,2012,31(06):61-64.白狄純,洪梓萌,郭娟娟,等.小站稻秸稈降解菌的篩選與酶活力測(cè)定[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2024,(03):114-118.宋東亮,沈君輝,李來(lái)庚.高等植物細(xì)胞壁中纖維素的合成[J].植物生理學(xué)通訊,2008(04):791-796.WangS,GuoX,LiangT,etal.MechanismresearchoncellulosepyrolysisbyPy-GC/MSandsubsequentdensityfunctionaltheorystudies[J].BioresourceTechnology,2012,104:722-728.PengL,KawagoeY,HoganP.Sitosterol-β-glucosideasprimerforcellulosesynthesisinplants[J].Science,2002,295(5552):147-150.FaheinaJuniorGS,SousaKA,ZilliJE,etal.EnhancedcellulaseproductionbytalaromycesamestolkiaeCMIAT055usingbananapseudostem[J].WasteandBiomassValorization,2022,13(8):3535-3546.張永芳,費(fèi)鵬飛,閻智鋒,等.廢棄纖維素紡織品水熱降解技術(shù)的研究進(jìn)展[J].紡織學(xué)報(bào),2023,44(12):216-224.SongH,JiaH,WangQ,etal.Anewenvironmentally-friendlysystemforextractingcellulosefromcornstraw:TheLowTemperatureLaccaseSystem[J].Materials,2020,13(2):437-441.佟碩秋,王嬙,林宗梅,等.纖維素降解菌研究進(jìn)展[J].山東化工,2020,49(3):2.LiP,HeC,LiG,etal.Biologicalpretreatmentofcornstrawforenhancingdegradationefficiencyandbiogasproduction[J].Bioengineered,2020,11(1):251-260.Azizi-ShotorkhoftA,MohammadabadiT,MotamediH,etal.Isolationandidenti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