2025第二人民醫(yī)院原位雜交技術(shù)考核一、單選題（共10題，每題2分，共20分）1.原位雜交技術(shù)中，用于標記探針的熒光素最常用于哪種應(yīng)用場景？A.病理組織切片觀察B.細胞培養(yǎng)計數(shù)C.基因敲除實驗D.蛋白質(zhì)印跡分析2.在RNA原位雜交實驗中，使用RNA酶消化是為了去除什么？A.背景信號B.DNA污染C.未雜交的探針D.蛋白質(zhì)殘留3.原位雜交技術(shù)中，探針的特異性主要取決于什么？A.探針的長度B.探針的GC含量C.探針的標記類型D.樣品的固定方法4.以下哪種方法不屬于原位雜交技術(shù)的固定方法？A.甲醇-醋酸法B.戊二醛固定法C.甲醛固定法D.乙醇脫水法5.原位雜交技術(shù)中，雜交溫度通常選擇多少？A.37℃B.42℃C.55℃D.100℃6.原位雜交技術(shù)中，雜交緩沖液的主要作用是什么？A.提供離子環(huán)境B.保護探針結(jié)構(gòu)C.促進探針與靶序列結(jié)合D.洗脫未結(jié)合探針7.原位雜交技術(shù)中，熒光信號的增強劑通常是什么？A.封閉劑B.酶標二抗C.抗熒光淬滅封片劑D.RNA酶8.在原位雜交實驗中，雜交后洗滌的目的是什么？A.增強信號強度B.去除未結(jié)合的探針C.固定雜交產(chǎn)物D.保護探針結(jié)構(gòu)9.原位雜交技術(shù)中，非特異性結(jié)合的減少主要通過什么方法實現(xiàn)？A.提高雜交溫度B.使用封閉劑C.增加探針濃度D.延長雜交時間10.原位雜交技術(shù)中，雜交后信號檢測最常用的方法是？A.免疫熒光染色B.顯微鏡觀察C.PCR擴增D.液體閃爍計數(shù)二、多選題（共5題，每題3分，共15分）1.原位雜交技術(shù)中，以下哪些屬于常用的探針標記方法？A.熒光素標記B.放射性同位素標記C.生物素標記D.地高辛標記2.原位雜交技術(shù)中，以下哪些因素會影響雜交效率？A.探針濃度B.樣品固定方法C.雜交溫度D.洗滌條件3.原位雜交技術(shù)中，以下哪些屬于非特異性結(jié)合的來源？A.探針與核酸的隨機結(jié)合B.樣品中的多聚嘌呤-嘧啶序列C.雜交緩沖液pH值過高D.探針標記過多4.原位雜交技術(shù)中，以下哪些屬于常用的固定方法？A.甲醇-醋酸法B.戊二醛固定法C.甲醛固定法D.乙醇脫水法5.原位雜交技術(shù)中，以下哪些屬于熒光信號的增強方法？A.抗熒光淬滅封片劑B.提高雜交溫度C.使用酶標二抗D.延長雜交時間三、判斷題（共10題，每題1分，共10分）1.原位雜交技術(shù)可以用于檢測活細胞內(nèi)的RNA表達。（×）2.原位雜交技術(shù)中，探針的GC含量越高，特異性越好。（√）3.原位雜交技術(shù)中，雜交后無需洗滌即可直接觀察信號。（×）4.原位雜交技術(shù)中，熒光信號的檢測通常使用倒置顯微鏡。（√）5.原位雜交技術(shù)中，放射性同位素標記的探針半衰期較長。（√）6.原位雜交技術(shù)中，樣品固定越久越好。（×）7.原位雜交技術(shù)中，雜交緩沖液中的鹽濃度越高越好。（×）8.原位雜交技術(shù)中，熒光信號的淬滅主要來自封片劑。（√）9.原位雜交技術(shù)中，RNA原位雜交需要使用RNA酶消化背景。（√）10.原位雜交技術(shù)中，探針的標記類型不影響雜交效率。（×）四、簡答題（共5題，每題5分，共25分）1.簡述原位雜交技術(shù)的原理及其在臨床診斷中的應(yīng)用。2.簡述原位雜交技術(shù)中，減少非特異性結(jié)合的常用方法。3.簡述原位雜交技術(shù)中，RNA原位雜交與DNA原位雜交的區(qū)別。4.簡述原位雜交技術(shù)中，雜交緩沖液的主要成分及其作用。5.簡述原位雜交技術(shù)中，熒光信號的增強方法及其原理。五、論述題（共2題，每題10分，共20分）1.結(jié)合第二人民醫(yī)院的臨床需求，論述原位雜交技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用價值。2.結(jié)合第二人民醫(yī)院的科研方向，論述原位雜交技術(shù)在基因表達調(diào)控研究中的應(yīng)用方法及注意事項。答案與解析一、單選題答案與解析1.A（病理組織切片觀察是熒光素標記探針最常用的應(yīng)用場景，其他選項均不適用。）2.C（RNA酶消化去除未雜交的探針，減少背景信號。）3.B（探針的GC含量越高，與靶序列的親和力越強，特異性越高。）4.D（乙醇脫水法不屬于原位雜交的固定方法，主要用于樣品脫水。）5.C（原位雜交技術(shù)中，雜交溫度通常選擇55℃左右，以促進探針與靶序列結(jié)合。）6.C（雜交緩沖液的主要作用是提供離子環(huán)境、穩(wěn)定pH值，促進探針與靶序列結(jié)合。）7.C（抗熒光淬滅封片劑可以增強熒光信號，延長觀察時間。）8.B（雜交后洗滌的目的是去除未結(jié)合的探針，減少背景信號。）9.B（使用封閉劑可以減少探針與樣品中非特異性序列的結(jié)合。）10.B（顯微鏡觀察是原位雜交技術(shù)最常用的信號檢測方法。）二、多選題答案與解析1.ABCD（熒光素、放射性同位素、生物素、地高辛均為常用的探針標記方法。）2.ABCD（探針濃度、樣品固定方法、雜交溫度、洗滌條件均會影響雜交效率。）3.ABC（非特異性結(jié)合的來源包括隨機結(jié)合、多聚嘌呤-嘧啶序列、pH值過高、探針標記過多。）4.ABCD（甲醇-醋酸法、戊二醛固定法、甲醛固定法、乙醇脫水法均為常用的固定方法。）5.AC（抗熒光淬滅封片劑和酶標二抗均可增強熒光信號，提高檢測靈敏度。）三、判斷題答案與解析1.×（原位雜交技術(shù)通常需要固定樣品，而活細胞固定會破壞其活性。）2.√（GC含量越高，雙鏈穩(wěn)定性越強，特異性越高。）3.×（雜交后需要洗滌去除未結(jié)合探針，否則背景信號會干擾結(jié)果。）4.√（熒光信號檢測通常使用倒置顯微鏡，可觀察組織切片的熒光信號。）5.√（放射性同位素標記的探針半衰期較長，但存在輻射安全問題。）6.×（樣品固定時間過長會導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破壞，影響雜交效果。）7.×（鹽濃度過高會降低探針與靶序列的結(jié)合能力。）8.√（封片劑中的淬滅劑會減少熒光信號的強度。）9.√（RNA原位雜交需要使用RNA酶消化去除細胞質(zhì)中的游離RNA。）10.×（探針的標記類型會影響雜交效率，如熒光素標記的探針信號更強。）四、簡答題答案與解析1.原位雜交技術(shù)的原理及其應(yīng)用原位雜交技術(shù)是利用標記的核酸探針與組織切片或細胞培養(yǎng)物中的靶核酸序列互補結(jié)合，通過檢測探針信號來定位和檢測特定基因或RNA的表達。在臨床診斷中，可用于腫瘤標志物的檢測、病原體檢測、基因表達分析等。例如，第二人民醫(yī)院可利用該技術(shù)檢測腫瘤組織的基因突變情況，輔助診斷和治療方案制定。2.減少非特異性結(jié)合的方法-使用封閉劑（如BSA、魚精蛋白）封閉樣品中的非特異性結(jié)合位點。-優(yōu)化雜交條件（如降低溫度、調(diào)整鹽濃度）。-使用特異性探針（如寡核苷酸探針）。-預(yù)雜交處理（如用未標記探針飽和結(jié)合位點）。3.RNA原位雜交與DNA原位雜交的區(qū)別-RNA原位雜交需使用RNA酶消化背景RNA，而DNA原位雜交無需此步驟。-RNA原位雜交通常使用熒光標記，而DNA原位雜交可使用熒光或放射性標記。-RNA原位雜交更適用于檢測mRNA表達，而DNA原位雜交主要用于檢測基因拷貝數(shù)或DNA序列。4.雜交緩沖液的主要成分及其作用-氯化鈉（提供離子環(huán)境，促進探針與靶序列結(jié)合）。-Tris-HCl（穩(wěn)定pH值，維持緩沖能力）。-葡萄糖（穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)，提高雜交效率）。-尿素或甲酰胺（降低GC序列的雜交溫度，提高靈活性）。5.熒光信號的增強方法及其原理-使用抗熒光淬滅封片劑（如DABCO，延長熒光信號壽命）。-使用酶標二抗放大信號（如辣根過氧化物酶標記，結(jié)合底物顯色增強信號）。-延長雜交時間（增加探針與靶序列結(jié)合機會）。五、論述題答案與解析1.原位雜交技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用價值第二人民醫(yī)院可利用原位雜交技術(shù)檢測腫瘤組織的基因表達譜，如KRAS、EGFR等基因突變，輔助診斷和靶向治療。例如，通過熒光原位雜交（FISH）檢測乳腺癌組織的HER2基因擴增，指導(dǎo)抗HER2藥物的使用；通過RNA原位雜交檢測腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤，評估免疫治療效果。該技術(shù)可提供空間分辨率高的基因表達信息，幫助醫(yī)生制定個性化治療方案。2.原位雜交技術(shù)在基因表達調(diào)控研究中的應(yīng)用方法及注意事項-應(yīng)用方法：1.樣品制備：使用甲醛固定組織切片，保證RNA完整性。2.探針設(shè)計：針對目標基因設(shè)計特異性寡核苷酸探針，并熒光標記。3.雜交條件優(yōu)化：調(diào)整雜交溫度、緩沖液成分等參數(shù)。4.信