1、植物抗蟲(chóng)基因工程,一、前言 蟲(chóng)害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)減收的主要原因之一。采用化學(xué)和生物農(nóng)藥等手段防治固然可以減輕害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物的危害,但這些方法不僅費(fèi)用較高(每年耗費(fèi)約10 億美元) ,而且由于害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性等原因,防治效果欠佳。全球每年因蟲(chóng)害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所造成的損失仍高達(dá)20 %30 %。長(zhǎng)期大量地施用農(nóng)藥除了使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性外,還會(huì)帶來(lái)一系列的社會(huì)問(wèn)題,如人畜中毒事故的發(fā)生、食物中農(nóng)藥的殘留以及環(huán)境污染等。 通過(guò)常規(guī)育種技術(shù)和試管培養(yǎng)技術(shù)雖然已獲得某些抗蟲(chóng)害的作物品種。如野生型馬鈴薯( solanum chacoense ) 和栽培型馬鈴薯(s.tuberosum ) 的原生質(zhì)體電融合獲得的體細(xì)胞雜合

2、品系對(duì)一種馬鈴薯甲蟲(chóng)具有抗性。然而, 新品種的選育需要較長(zhǎng)的時(shí)間, 并且某些蟲(chóng)害尚無(wú)基因資源作為雜交的親本。所以, 用這種途徑來(lái)獲得抗蟲(chóng)作物是很困難的。,玉米田里的蟲(chóng)害,為害癥狀,粘蟲(chóng) （又稱行軍蟲(chóng)或剃稈蟲(chóng) ）,水稻田里的蟲(chóng)害,稻薊馬危害狀 （受害葉葉尖枯黃，甚至枯死）,稻薊馬成蟲(chóng),植物抗蟲(chóng)基因工程的研究之所以能取得如此迅猛的發(fā)展,主要是由于利用基因工程培育抗蟲(chóng)作物新品種或新品系具有以下幾個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn): 保護(hù)作用具有連續(xù)性,可控制植物整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)害蟲(chóng)的危害; (2) 對(duì)整個(gè)植株都有保護(hù)作用,包括化學(xué)殺蟲(chóng)劑很難接觸的葉下表面及根部等; (3)對(duì)害蟲(chóng)毒性具有專一性; (4) 可大大縮短育種周期,降

3、低成本; (5) 所表達(dá)出的殺蟲(chóng)蛋白存在于植物體內(nèi),不易被氣候等環(huán)境因素破壞，不存在環(huán)境污染; (6)基因資源非常豐富 。目前全世界最常改良的性狀中抗蟲(chóng)占第二位(24%)。,二、抗蟲(chóng)基因 人們已從微生物細(xì)菌中、植物本身以及昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離到許多抗蟲(chóng)基因，有許多抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物正在進(jìn)行田間試驗(yàn)，并有一些品種已商品化。迄今發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于提高植物抗蟲(chóng)性的基因主要有兩類:一類是從微生物、細(xì)菌中分離出來(lái)的抗蟲(chóng)基因，如蘇云金桿菌毒蛋白基因(bt基因)、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)，另一類是從植物中分離出來(lái)的抗蟲(chóng)基因，如蛋白酶抑制劑基因(pi基因)、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。其中bt基因和pi基因在

4、農(nóng)業(yè)上利用最廣。此外，昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因等也在研究當(dāng)中。,1 來(lái)源于微生物、細(xì)菌中的抗蟲(chóng)基因 1.1 b . t . 殺蟲(chóng)晶體蛋白基因 蘇云金芽孢桿菌( bacillus thuringiensis) 是一種革藍(lán)氏陽(yáng)性土壤芽孢桿菌,在形成芽孢時(shí),可產(chǎn)生殺死昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的蛋白質(zhì),即通常所說(shuō)的殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal protein) 或- 內(nèi)毒素( - endotoxin) , 也稱蘇云金芽孢桿菌毒蛋白( b . t . toxic protein) 。它是目前世界上生產(chǎn)量最大的生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑,廣泛用于防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)等方面的害蟲(chóng) 。,b . t . 殺蟲(chóng)晶體蛋白是一

5、類分子量為130160kd 的蛋白質(zhì),在昆蟲(chóng)中腸堿性和還原性的環(huán)境下,被降解成6575 kd 的活性小肽,并和中腸紋緣膜上的受體結(jié)合。現(xiàn)已證明受體為氨肽酶n 和鈣粘著蛋白(cadherin) 類似物。與受體結(jié)合的活性小肽插入到細(xì)胞膜上并形成穿孔,使細(xì)胞膜周質(zhì)和中膜腔之間的離子平衡破壞,引起細(xì)胞腫脹甚至裂解,從而導(dǎo)致昆蟲(chóng)癱瘓或死亡。,bt抗蟲(chóng)棉,鱗翅目 鞘翅目 雙翅目,近年來(lái)人們?cè)趖毒蛋白基因的修飾與改造、表達(dá)載體的構(gòu)建、植物組織化等方面作了大量的工作。 盡管bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的殺蟲(chóng)效果非常好，但其殺蟲(chóng)譜較窄，對(duì)其敏感的主要是鱗翅目和鞘翅目的一些害蟲(chóng)，如棉鈴蟲(chóng)、玉米螟、馬鈴薯甲蟲(chóng)等。,1.2 其他

6、來(lái)源于微生物的抗蟲(chóng)基因 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶( ipt ) 是細(xì)胞分裂素合成中的關(guān)鍵酶,來(lái)源于agrobacterium tumefaciens (根瘤土壤桿菌)的ipt 基因在煙草、番茄中表達(dá)后,可減少煙草夜蛾對(duì)葉片的損傷,并降低桃蚜的生存力。然而, ipt 基因的表達(dá)對(duì)植物發(fā)育有負(fù)面影響,如使根系發(fā)育不完全,降低葉綠素含量等。,2 來(lái)源于高等植物的抗蟲(chóng)基因 2.1 蛋白酶抑制基因 蛋白酶抑制劑( proteinase inhibitor , pi) 是自然界含量最為豐富的蛋白種類之一,是植物天然防御系統(tǒng)中的一部分,可抵抗食草動(dòng)物的侵食. 其機(jī)理在于它能與昆蟲(chóng)消化道內(nèi)的蛋白消化酶相互作用,形成酶抑

7、制劑復(fù)合物,阻斷或減弱消化酶的蛋白水解作用,刺激消化酶的過(guò)量分泌,使昆蟲(chóng)產(chǎn)生厭食反應(yīng),導(dǎo)致非正常發(fā)育或死亡. 目前,至少有14 種蛋白酶抑制基因已轉(zhuǎn)入作物中. 其中令人注目的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因cowpea trypsin inhibitor ,cpti),馬鈴薯蛋白抑制劑基因(potato proteinase inhibitor ,pi ),及水稻巰基蛋白酶抑制基因(oryzacystatin).,蛋白酶抑制基因在抗蟲(chóng)植物基因工程中之所以地位突出,是因?yàn)?不易產(chǎn)生耐受性問(wèn)題; 抗蟲(chóng)譜廣; 其來(lái)源于植物易為公眾所接受,并已證明對(duì)人畜無(wú)副作用. 而且最近的研究資料表明,食用天然的植物蛋白酶

8、抑制劑具有抗腸癌的作用.,2.2 淀粉酶抑制劑基因 淀粉酶抑制劑基因分布也較廣，以禾谷類作物和豆科植物種子中的含量最為豐富，在植物對(duì)病蟲(chóng)害侵染的天然防御系統(tǒng)中起著重要的作用(richardson，1997)。 這類酶抑制劑能抑制昆蟲(chóng)消化道內(nèi) 淀粉酶活性，使食入的淀粉無(wú)法水解，阻斷了昆蟲(chóng)主要能量來(lái)源；并刺激昆蟲(chóng)過(guò)量分泌消化酶，通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)反饋產(chǎn)生厭食反應(yīng)。,2.3 植物凝集素基因 植物凝集素是一類糖結(jié)合蛋白,也是植物防御系統(tǒng)的一個(gè)組成部分。第一個(gè)被描述具有抗蟲(chóng)作用的凝集素是菜豆凝集素( pha) ,它實(shí)際上是一種- 淀粉酶抑制劑。1993 年英國(guó)科學(xué)工作者從雪花蓮中克隆出雪花蓮凝集素基因( gn

9、a) ,對(duì)稻飛虱、葉蟬、蚜蟲(chóng)等有毒性作用?，F(xiàn)在gna 基因已作為一種抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化其他作物。我國(guó)黃大昉等(1997) 也報(bào)道來(lái)源于掌葉半夏和半夏的凝集素對(duì)麥管蚜、棉蚜、桃蚜等有致死作用。 目前成功用于植物抗蟲(chóng)基因工程的凝集素基因有: 雪花蓮凝集素( gna) 基因、豌豆凝集素( p -lec) 基因、麥胚凝集素( wga) 基因及半夏凝集素(pta) 基因。,雪花蓮,2.4 來(lái)源于高等植物的其他抗蟲(chóng)基因 幾丁質(zhì)酶(chitinase) 是廣泛存在于微生物和植物體內(nèi)的一類蛋白,1989 年ary 等從job草中分離得到一種幾丁質(zhì)酶,發(fā)現(xiàn)它能抑制淀粉酶的活性,破壞昆蟲(chóng)腸上皮的保護(hù)層,導(dǎo)致消化道損傷.

10、 從而有效抑制蝗蟲(chóng)等昆蟲(chóng)類,但其在實(shí)際應(yīng)用與理論相差較大.煙草陰離子過(guò)氧化物酶基因在煙草、番茄中表達(dá)時(shí),可產(chǎn)生對(duì)鱗翅類,鞘翅類以及桃蚜的抗性,該酶作用是很復(fù)雜的,大部分人認(rèn)為其作用不是直接的,而主要是其產(chǎn)物的影響. 此外,色氨酸脫羥酶( tryptophan decaiboxylase , tdc) ,核糖體滅活基因(ribosome inactive protein ,rip) . 豌豆脂肪氧化酶(pea lipoxygenase), 海藻糖酶抑制基因( trehalosfatin) ,番茄素( tomatime) ,多酚氧化酶( ppo) 和,脂氧化酶(lox) 都對(duì)昆蟲(chóng)有毒害作用.,3

11、昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因 昆蟲(chóng)神經(jīng)激素是已知三大昆蟲(chóng)激素的一種, 它控制著昆蟲(chóng)許多關(guān)鍵的生理過(guò)程, 影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、變態(tài)、生殖、代謝和行為等, 近年來(lái), 人們已開(kāi)始在基因工程中利用昆蟲(chóng)神經(jīng)激素防治害蟲(chóng)。目前, 蝎毒素和蜘蛛毒素兩種昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素已被用于植物抗蟲(chóng)基因工程。由于昆蟲(chóng)毒素專一作用于昆蟲(chóng)而對(duì)于哺乳動(dòng)物無(wú)害或毒性很小, 因此可開(kāi)發(fā)作為一種高效生物殺蟲(chóng)劑。,4 新殺蟲(chóng)基因的應(yīng)用 傳統(tǒng)抗蟲(chóng)基因主要是從人們熟知的具有殺蟲(chóng)能力的生物中克隆出來(lái)的,如從蘇云金芽孢桿菌中克隆b . t . 殺蟲(chóng)晶體蛋白基因,而蘇云金芽孢桿菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑已在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用了幾十年。新抗蟲(chóng)基因除了繼續(xù)從這類已知具有殺

12、蟲(chóng)能力的生物中克隆外(如營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白基因) ,還采用了普遍篩選的方法,即用來(lái)作殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)的樣本可以是任意來(lái)源的植物組織、微生物發(fā)酵液以及商品化的蛋白質(zhì)等。采用對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害較大,但又不好控制的害蟲(chóng)作為篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)象。一旦出現(xiàn)殺蟲(chóng)效果明顯的實(shí)驗(yàn)即進(jìn)行跟蹤鑒定,確定殺蟲(chóng)物質(zhì)是否為蛋白質(zhì)。如果是蛋白質(zhì),則根據(jù)此蛋白的功能、殺蟲(chóng)效率、殺蟲(chóng)的作用機(jī)理來(lái)判斷其作為新一代殺蟲(chóng)蛋白的潛在價(jià)值。第二代抗蟲(chóng)基因中的膽固醇氧化酶基因就是以此方法發(fā)現(xiàn)并克隆的。,4.1 膽固醇氧化酶基因 膽固醇氧化酶是膽固醇代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。膽固醇氧化酶的殺蟲(chóng)譜相當(dāng)寬,對(duì)鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目和同翅目的害蟲(chóng)都有不同程度的作用

13、。它能氧化害蟲(chóng)生物膜上的膽固醇,在較低濃度時(shí),能使害蟲(chóng)的中腸紋緣膜受到破壞;在較高濃度時(shí),能發(fā)生完全的溶胞現(xiàn)象,從而膜的結(jié)構(gòu)和功能都發(fā)生變化以致引起害蟲(chóng)死亡,這一過(guò)程的生化機(jī)制目前還正在研究。 4.2 營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白基因 營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白是另一類高效殺蟲(chóng)蛋白質(zhì),它的敏感害蟲(chóng)是另一種對(duì)b. t . 毒蛋白不敏感的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)鱗翅目的地老虎。 這類蛋白可能與敏感昆蟲(chóng)表皮細(xì)胞,尤其是柱狀細(xì)胞相結(jié)合,造成細(xì)胞分解,伴隨著腸道嚴(yán)重受損,受害昆蟲(chóng)迅速死亡。,三、抗蟲(chóng)基因工程的問(wèn)題及展望 伴隨抗蟲(chóng)基因工程進(jìn)展，其在應(yīng)用方面潛在的問(wèn)題也日益顯露。 1 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中昆蟲(chóng)的抗性問(wèn)題 害蟲(chóng)的抗性是指一個(gè)種群在遺傳基礎(chǔ)

14、上降低了對(duì)某一種殺蟲(chóng)劑的敏感性。 目前較常采用的方法有： (1)使用組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子和損傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子等特殊的啟動(dòng)子； (2)采取2個(gè)或2個(gè)以上不同殺蟲(chóng)機(jī)理的抗蟲(chóng)基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物中； (3)提供“避難所” 等。,2 “基因沉默”現(xiàn)象 無(wú)論是哪種來(lái)源的抗蟲(chóng)基因用于基因工程首要考慮的問(wèn)題就是提高其表達(dá)量。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)量越高，抗蟲(chóng)效果就越好。導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因翻譯水平不高是普遍存在的問(wèn)題，因此，如何提高外源抗蟲(chóng)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)，是植物抗蟲(chóng)基因工程的一個(gè)重要研究方向。,3 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物的安全性是一個(gè)長(zhǎng)期、重要而且復(fù)雜的問(wèn)題，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待。抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的直接生態(tài)效應(yīng)是對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)種群的控制，但靶標(biāo)昆蟲(chóng)有無(wú)向其他寄主植物轉(zhuǎn)移的可能；害蟲(chóng)天敵種群會(huì)受到怎樣的影響；次要害蟲(chóng)是否會(huì)變?yōu)橹饕οx(chóng)；靠轉(zhuǎn)基因作物的逃逸或從作物雜交中獲取轉(zhuǎn)基因抗性的植物是否會(huì)對(duì)自然植物群落產(chǎn)生嚴(yán)重影響都是需進(jìn)一步研究的問(wèn)題。為了防止選擇基因或報(bào)告基因的潛在風(fēng)險(xiǎn)，目前，世界