1、微生物工程與設(shè)備,湖師院生科院,第一節(jié) 谷氨酸,生物合成途徑：糖經(jīng)過酵解途徑（EMP)和單磷酸己糖途徑（HMP）生成丙酮酸。一方面，丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA，另一方面，經(jīng)CO2固定作用生成草酰乙酸，兩者合成檸檬酸進入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），由三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶催化下，還原氨基化合成谷氨酸。 合成途徑包括EMP、HMP、TCA循環(huán)，乙醛酸循環(huán)（DCA）和CO2的固定作用。,總反應(yīng)式 C6H12O6+NH3+3/2O2 C5H9O4N+CO2+3H2O 理論轉(zhuǎn)化率：（147/180）100%=81.7%,第十八章 燃料和工業(yè)化學(xué)品,谷氨酸的生物合成途徑,第一節(jié) 谷

2、氨酸,一、EMP和HMP,1. EMP途徑,葡萄糖 丙酮酸 生成不同產(chǎn)物,2. HMP途徑,6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸，后者生成5-磷酸戊糖，通過戊糖代謝分解成3C化合物和2C化合物，3C化合物與EMP途徑聯(lián)系，2C化合物進入TCA.,第一節(jié) 谷氨酸,生物素充足菌：HMP途徑所占比例為38% 生物素亞適量菌：HMP途徑所占比例為26%,第一節(jié) 谷氨酸,一、EMP和HMP,二、TCA、DCA和CO2固定作用,1. TCA循環(huán),-酮戊二酸脫氫酶： 活力很弱，使糖代謝流進入TCA循環(huán)后受阻在-酮戊二酸處，在有NH4+存在下，由谷氨酸脫氫酶催化還原氨基化生成谷氨

3、酸,第一節(jié) 谷氨酸,2. DCA循環(huán)（乙醛酸循環(huán)）,作為TCA循環(huán)有缺陷時C4二羧酸的補充，特別是以醋酸和乙醇為原料的谷氨酸發(fā)酵，它是C4二羧酸的唯一補充來源 作為能量供給來源的末端氧化系,3C6H12O6 6丙酮酸 6醋酸 6醋酸 +2NH3+3O2 2C5H9O4N+2CO2+6H2O,轉(zhuǎn)化率：2 147/（3180）100%=54.4%,二、TCA、DCA和CO2固定作用,第一節(jié) 谷氨酸,3. CO2固定,在谷氨酸產(chǎn)生菌中已檢出兩種CO2固定酶： 磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶和蘋果酸酶,PEP羧化酶對PEP的表現(xiàn)親和力約是丙酮酸激酶的1/10,二、TCA、DCA和CO2固定作用,第一節(jié)

4、 谷氨酸,所以在谷氨酸發(fā)酵中，糖的分解代謝途徑與CO2固定的適當比例是提高谷氨酸對糖收率的關(guān)鍵問題。,第一節(jié) 谷氨酸,三、氨的導(dǎo)入,糖代謝中間體-酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸 天冬氨酸或丙氨酸通過氨基轉(zhuǎn)移作用將氨基轉(zhuǎn)給-酮戊二酸而生成 谷氨酸合成酶途徑,導(dǎo)入方式,異檸檬酸脫氫酶：需NADP為輔酶，催化-酮戊二酸的生成（谷氨酸的前體），并為谷氨酸脫氫酶提供輔酶 谷氨酸脫氫酶：需NADPH+H+為輔酶,活細胞中，異檸檬酸脫氫酶活性小于谷氨酸脫氫酶活性,第一節(jié) 谷氨酸,黃色短桿菌中，谷氨酸脫氫酶對-酮戊二酸和谷氨酸表現(xiàn)出同促相互作用，低濃度的-酮戊二酸和谷氨酸對此酶有顯著的激活作用。 谷氨酸的生成被

5、反應(yīng)產(chǎn)物谷氨酸所抑制。 逆反應(yīng)又被NH4+和-酮戊二酸所抑制。,生物素缺乏菌,NH4+存在：葡萄糖消耗速度快，谷氨酸生成收率高 NH4+不存在：糖消耗速度慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸,生物素充足菌：NH4+幾乎不影響糖代謝,生物素和NH4+對糖代謝的影響：,三、氨的導(dǎo)入,第一節(jié) 谷氨酸,20世紀70年代初，在細菌中發(fā)現(xiàn)了谷氨酸合成酶途徑,谷氨酸合成酶對NH4+的親和力比谷氨酸脫氫酶強的多。,谷氨酸發(fā)酵，細胞內(nèi)的谷氨酸濃度高，反饋抑制谷氨酸脫氫酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶,三、氨的導(dǎo)入,第一節(jié) 谷氨酸,在生物素貧乏和豐富培養(yǎng)基中生長的黃色短桿菌體內(nèi)游離的和培養(yǎng)基中存在的氨基酸組成

6、及洗滌影響,第一節(jié) 谷氨酸,四、菌種選育,在生物素貧乏培養(yǎng)基中積累大量谷氨酸，而在生物素豐富的培養(yǎng)基中幾乎不積累谷氨酸 生物素貧乏的細胞內(nèi)，谷氨酸含量少，而且容易被洗出，在生物素豐富的細胞內(nèi)含有大量谷氨酸，而且不易被洗出，只有用表面活性劑處理才能洗出,硫殖短桿菌體內(nèi)油酸量和體外谷氨酸生成量,研究發(fā)現(xiàn)一些菌體內(nèi)，當飽和脂肪酸增加，不飽和脂肪酸減少，它們間的比例超過1時，有利于谷氨酸的分泌。,不飽和脂肪酸以油酸為主，油酸對細胞膜的谷氨酸通透性不利，有礙谷氨酸排出體外,第一節(jié) 谷氨酸,四、菌種選育,后來研究發(fā)現(xiàn)細胞膜的谷氨酸通透性受細胞膜的磷脂含量控制，關(guān)于不飽和脂肪酸對谷氨酸分泌的影響，也是由于不飽和脂肪酸減少而導(dǎo)致磷脂含量減少。,細菌細胞的谷氨酸排出控制機制,第一節(jié) 谷氨酸,四、菌種選育,磷 脂 結(jié) 構(gòu),第一節(jié) 谷氨酸,四、菌種選育,1、生物素缺陷型,生物素：脂肪酸生物合成中乙酰-CoA羧化酶的輔酶，催化乙酰CoA合成丙二酰- CoA,第一節(jié) 谷氨酸,四、菌種選育,生物素缺陷型： 阻斷了生物素的合成，限制外源生物素供應(yīng)量 抑制了不飽和脂肪酸的合成 磷脂含量減少，從而含量不足 細胞膜結(jié)構(gòu)不完整 提高了細胞膜的谷氨酸通透型,當原料中生物素豐富，則可以在發(fā)酵過程中添加： 飽和脂肪酸的表面活性劑：促使脂肪酸和它的表面活性 劑對生物素有拮抗作用，阻斷不飽和脂肪酸的合成 青霉素：抑制細胞