1、1,酵母表達(dá)系統(tǒng),優(yōu)點(diǎn) 1 屬于真核生物,可進(jìn)行翻譯后修飾,如糖基化 2 操作容易 3 經(jīng)濟(jì) 4 快速,2,酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu),3,兩種酵母表達(dá)系統(tǒng),釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) Saccharomyces cerevisiae 過去常用,畢赤酵母 Pichia pastoris 現(xiàn)在多用,4,Pichia pastoris 表達(dá)系統(tǒng),Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源. 易操作,培養(yǎng)容易 表達(dá)量高, 可達(dá)培養(yǎng)液中10 g/L 可以有真核生物的翻譯后修飾, 如糖基化 避免了釀酒酵母的過糖基化問題,5,6,1. Pichia pastoris 的表達(dá)載體,胞內(nèi)表達(dá)載體,P.

2、 pastoris沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型載體作為外源基因的表達(dá)載體,7,Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 將甲醇氧化成甲醛 通過高表達(dá)來補(bǔ)償酶活性不足,因此有強(qiáng)啟動(dòng)子,AOX1 是主要的酶 受甲醇嚴(yán)格控制 啟動(dòng)子用來驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá),AOX2 利用甲醇的能力低 生長慢,8,宿主His4突變，不能合成組氨酸， 在His缺陷培養(yǎng)基上不能生長； 質(zhì)粒上有His4, 可合成組氨酸， 用His缺陷平板篩選轉(zhuǎn)化菌株。,histidinol dehydrogenase gene (his4),9,2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR,10,胞內(nèi)表達(dá)載體, p

3、AO815,11,胞外表達(dá)載體, pIC9K,12,pPIC9k, 胞外表達(dá)載體,13,3. 多拷貝產(chǎn)生，pIC9K, 體內(nèi)形成多拷貝,因?yàn)槲淳€性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源 重組的幾率非常低,未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒發(fā)生同源 重組的幾率非常低,14,pAO815 可體外構(gòu)建多拷貝,15,BamH I：GGATCC CCTAGG,Bgl II：AGATCT TCTAGA,16,4. 宿主細(xì)胞 Pichia Strain 基因型,GS115 AOX1正常，Mul+,KM71 AOX1被破壞， MulS,宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突變 可以在完全培養(yǎng)基Y

4、PD和含組氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長 在表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入后才能在組氨酸缺陷培養(yǎng)基上生長 本身的回復(fù)突變?yōu)?/108。,17,轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的甲醇利用能力,GS115,KM71,AOX1正常，Mul+,AOX1被破壞， MulS,轉(zhuǎn)化后對(duì)甲醇的利用,KM71無論在那里交換，只能是甲醇低利用，因?yàn)樗拗鳑]有AOX1,甲醇高利用 Sal I 、 Stu I切,甲醇低利用 Bgl II切,GS115取決于質(zhì)粒在宿主細(xì)胞基因組上交換的位置是否破壞宿主的AOX1,18,線性化位點(diǎn),質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,線性化質(zhì)粒發(fā)生同源 重組的幾率提高,19,pAO815和pPIC9K 在Sal I 、Stu I 單切, 在his

5、 4插入（單交換），不破壞宿主的AOX1，轉(zhuǎn)化GS115后產(chǎn)生： His +/Mut+,單交換,同源重組基因轉(zhuǎn)移法 ：是將外源基因定位導(dǎo)人受體細(xì)胞染色體上的方法，因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)人基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換原有基因片段。,20,pAO815和pPIC9K 在Bgl II雙切： 在5AOX1位點(diǎn)和3AOX1雙交換，替換掉了宿主的AOX1基因， 轉(zhuǎn)化后GS115產(chǎn)生 His +/Muts,Bgl II,His4,5 AOX1,3AOX1,gene,His4,AOX1,21,22,技術(shù)路線,選擇合適的內(nèi)切酶位點(diǎn) 將基因插入載體,注:pAO815 和pIC9K是穿梭載體, 可

6、在大腸桿菌中操作,pAO815 體外構(gòu)建多拷貝,轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,線性化質(zhì)粒,組氨酸缺陷平板 篩選重組子,23,G418 篩選pIC9K 多拷貝,PCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的基因插入,誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE檢測(cè),pAO815和pPIC9K,24,酵母菌轉(zhuǎn)化,PEG 1000 Transformation Method for Pichia,Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N-二羥乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 ) Buffer B: 40% (w/v) Poly

7、ethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35 Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35 Filter sterilize and store at -20C.,25,制備感受態(tài)細(xì)胞,1. 劃線接種酵母菌，YPD平板， 30C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30C 搖過夜. 3. 轉(zhuǎn)培養(yǎng)到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and grow at 30C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x

8、 g 收集細(xì)胞， 用50 ml of Buffer A洗細(xì)胞，室溫. 5. 細(xì)胞懸浮在 4 ml of Buffer A 中，分裝成0.2 ml于滅菌的管中， 每管加 11 l DMSO（-70度） ，混勻，液氮快速冷凍， -70C保存。,26,保持感受態(tài)細(xì)胞在冰凍狀態(tài)作轉(zhuǎn)化！,Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. It is critical to add DNA to frozen cell samples. To perform multiple transfo

9、rmations, it is recommended to process them in groups of six at a time.,27,Transformation,1. 10-50 g DNA（20 l液體中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 g of denatured and sonicated salmon sperm DNA）； 2. 37C 水浴5分鐘， 中間混勻兩次； 3. 加 1.5 ml of Buffer B ， 徹底混勻； 4. 30C水浴1 hour； 5. 2000 x g 離心10 ， RT，

10、 去上清，細(xì)胞懸浮在 1.5 ml Buffer C中； 6. 離心后將細(xì)胞懸浮在 0.2 ml Buffer C中； 7. 將細(xì)胞涂布在選擇培養(yǎng)平板（MD）上， 30C for 3 to 4 days.,28,儲(chǔ)存液,10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids) ，抽濾； 500X B (0.02% Biotin) ，抽濾； 10X D (20% Dextrose葡萄糖 )，抽濾； 10X M (5% Methanol)， 抽濾； 10X GY (10% Glycerol)，高壓；

11、1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0， 高壓。,29,YPD培養(yǎng)基,Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter) 1% yeast extract 2% peptone 900 ml of water Autoclave for 20 minutes on liquid cycle. 2% dextrose (glucose)， （20%儲(chǔ)存液，抽濾滅菌）。 Note: Add 20 g of agar if making YPD plates。,30,Minimal Dextrose MD平板,成分：1

12、.34% YNB（yeast nitrogen base，酵母培養(yǎng)基） 4 x 10-5 % biotin 2% dextrose 配制方法： 1. 800 ml 水， （平板加15 g agar），滅菌 20 ； 2. 冷卻到 60C ， 加100 ml of 10 X YNB，2 ml of 500 X biotin，100 ml of 10 X dextrose； 3. 倒平板。,31,BMGY： Buffered Glycerol-complex MediumBMMY： Buffered Methanol-complex Medium (1 liter),成分：1% yeast ext

13、ract 2% peptone 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% YNB 4 x 10-5% biotin 1% glycerol （ BMGY ）or 0.5% methanol（ BMMY）,32,33,34,35,畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)： 1.蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。 2. 操作時(shí)與E. coli及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、簡單、廉價(jià)，且表達(dá)水平更高。 3.同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點(diǎn)，且它的外源蛋白表達(dá)水平是后者的十倍以至百倍。 這些使得畢赤

14、酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。,36,畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項(xiàng),嚴(yán)格無菌操作，防止污染；可以鏡檢 溫度30C; 轉(zhuǎn)化 PCR檢測(cè) 5. 誘導(dǎo)時(shí)間,37,酵母蛋白糖基化,釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型； 然而畢赤酵母中蛋白翻譯后所增加的寡糖鏈長度（平均每個(gè)支鏈8-14 個(gè)甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50-150 個(gè)甘露糖殘基）短得多，但比人的大； 釀酒酵母核心寡糖有末端-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒有。一般認(rèn)為-1,3聚糖接頭與蛋白的超抗原性有關(guān)，使得這些蛋白不適于治療應(yīng)用。,38,蛋白質(zhì)糖基化,蛋白質(zhì)的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式 ； 糖基化影響蛋白折疊、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。,39,1、N-linked glycosylation a sugar attach to the amino group of an asparagine （天冬氨酰）. sequence motif Asn-Xaa-Ser/Thr,40,2、O-linked glycosylation, In O-glycosylation, a sugar is attached to the hydroxyl group of a serine or threonine residue.,no s