1、課題二 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),專題二 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,【課題背景】,尿素CO(NH2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。 只有被土壤中細(xì)菌分解為NH3才能被植物吸收利用。,CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,研究思路,(一)篩選菌種,1 實(shí)例： 尋找耐高溫的DNA聚合酶,PCR技術(shù)：要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,耐高溫的酶,耐高溫生物體,耐高溫環(huán)境（熱泉、火山口）,尋找,尋找,Taq細(xì)菌,啟示：,尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)_，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,生存環(huán)境的要求,篩選原因: 因?yàn)闊崛母邷貤l件淘汰了絕大多數(shù)微生物， 使耐熱的Taq細(xì)菌保留下來(lái)。,2 實(shí)驗(yàn)室中微生物的

2、篩選原理,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。,思考:1.該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？,碳源：葡萄糖,氮源：尿素,2.從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？,固體培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,3. 此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？,原則上能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。,3 選擇培養(yǎng)基：,在微生物學(xué)中，將允許_，同時(shí)_生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。,特定種類的微生物生長(zhǎng),抑制或阻止其他種類微生物,結(jié)果： 培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)稀釋涂布平板等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,如何對(duì)細(xì)菌

3、進(jìn)行計(jì)數(shù)？,（1）顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板），在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,400104,每個(gè)小方格酵母菌數(shù),酵母菌細(xì)胞總數(shù),=,稀釋倍數(shù),不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn),（2） 稀釋涂布平板法（間接計(jì)數(shù)）,101,102,103,104,105,106,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，即一個(gè)

4、菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。,原理：,(二)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,方法：運(yùn)用稀釋涂布平板法來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)。,原理：1個(gè)菌落1個(gè)活菌,選擇菌落數(shù)在30300的平板上計(jì)數(shù)。 需培養(yǎng)計(jì)算出三個(gè)或三個(gè)以上的平板菌落,求平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,注意事項(xiàng)：,討論你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問(wèn)題，錯(cuò)在哪？,第一位同學(xué)：沒(méi)有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個(gè)平板） 第二位同學(xué)：A組結(jié)果誤差過(guò)大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值,(三)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn),閱讀課本 “（三）設(shè)置對(duì)照”一段討論教材中提出的問(wèn)題。,設(shè)置對(duì)照的目的：,排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

5、的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,(1)A同學(xué)出現(xiàn)此結(jié)果的可能原因？,土樣不同 培養(yǎng)基污染 (或混入了其他的含氮物質(zhì)),(2)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素？,這個(gè)實(shí)例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明_；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在_。,A無(wú)誤,培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)流程：,樣品稀釋涂布平板,微生物的培養(yǎng)與觀察,菌落計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),土壤取樣,制備培養(yǎng)基,（一）土

6、壤取樣,從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤(rùn)土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,“微生物的天然培養(yǎng)基”,數(shù)量最大、種類最多,大約70%90%是細(xì)菌,（二）制備培養(yǎng)基,制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源） 制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。,（對(duì)照作用）,思考？為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？,（三）樣品稀釋涂布平板,稀釋倍數(shù)為 101 106。每個(gè)稀釋度均用3個(gè)選擇培養(yǎng)基 和1個(gè)蛋白胨培養(yǎng)基。,（四）微生物的培養(yǎng)與觀察,在

7、菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。,菌落,菌落,一無(wú)菌操作 1.取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2.應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。 3.在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種

8、類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 三制定計(jì)劃,操作提示,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？,對(duì)照的培養(yǎng)皿無(wú)菌落說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有污染。 牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目多于選擇培養(yǎng)基的菌落數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,2.獲得某一稀釋度下，菌落數(shù)30300的平板，在這一稀釋度下是否至少有兩個(gè)平板的菌落數(shù)相接近？,相接近，說(shuō)明操作成功。,課題延伸,1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。,2.測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，將濾膜放到 伊紅-美藍(lán) 培

9、養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過(guò)記算得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,本課題知識(shí)小結(jié):,鞏固練習(xí),1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別,C,2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是 ( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,D,3.下列說(shuō)法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚 合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多,B,4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.