1、蘇景寬，國家自然科學基金委醫(yī)學教育司，2003年1月，1，第一部分：基金委主持項目評估的基本程序和重要環(huán)節(jié)，2，初步評審：由各學科部門組織實施。申請人無資格申請或違反相關規(guī)定的；手續(xù)不全或者申請不符合要求的；內容不符合資助范圍或超出資助能力的；申請人過去資助的項目沒有得到很好的實施。3、查重：由基金委信息中心組織實施。高等職業(yè)教育的申請和承諾(包括參與)不超過3項。在職研究生不是有限申請的條件，只能申請表面項目；申請人只能同時申請一個項目，每個項目申請人限一人；本年度內，高職申請者申請并承擔的研究領域項目不超過兩個；沒有受過高等職業(yè)教育的申請人申請并負責的研究項目不超過一個；青年基金只能得到一

2、筆贈款。同行評議(初審):由國家自然科學基金委各學科部門組織實施。基本程序：為每個申請選擇同行評審專家(5名)；請同行評議：對項目進行定性和定量評估；收回評估卡；定量部分的計算機解釋、評分和分類；根據學科支持的130個項目數量，確定第二輪評估項目。5，由專家評審組或專業(yè)委員會評審(二審)。主要是對推薦項目進行初審，篩選出30個。再次審核第二次試驗會議確定的資助項目；進一步核對重復項目；過去承擔的項目是否按時完成；是否違反基金會委員會的相關申請規(guī)定?；鹞瘑T會委員會進行了審議。發(fā)布批準和不批準通知。第二部分，國家自然科學基金申請表的撰寫。摘要(限400字)包括：研究方法、內容、目標、科學意義等。

3、如：“用方法(手段)研究、探索/證明問題對于闡明機理、揭示規(guī)律、提供思路奠定基礎具有重要意義”，8通過將基因轉染入晶狀體上皮細胞體內和體外培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白和晶狀體蛋白的變化，并研究基因的功能。從晶狀體上皮細胞的角度闡明老年性白內障的分子生物學機制，為白內障的防治提供新的思路和理論依據。在基礎研究的基礎上，著眼于國際科學發(fā)展趨勢，討論項目和應用基礎研究的科學意義，著眼于學科前沿，圍繞國民經濟和社會發(fā)展中的重大科技問題，從研究領域(疾病預防與控制)的研究方向出發(fā)，總結分析本項目需要解決的問題，提出思路，從研究領域(疾病書寫方法：從疾病入手)出發(fā)，簡述其特點、危害、目前主要治

4、療方法和存在的問題。簡要分析了該病的發(fā)病機理和主要研究熱點，引出了目前存在的主要問題，即本項目需要解決的問題，并以此為切入點提出了設想，闡述了如果達到預期目標，對該病乃至相關疾病的防治具有理論意義和臨床價值。老年性白內障是一種年齡相關性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長而增加。特別是隨著人類的老齡化，白內障患者的數量將繼續(xù)增加。目前，它是人類的第一種致盲疾病。目前，治療白內障的唯一有效方法是摘除混濁晶狀體并植入人工晶狀體。盡管手術后患者可以恢復良好的視力，但不可避免的術后并發(fā)癥以及手術設備和材料成本高昂，用于白內障治療的資金已經成為世界各國，包括富裕發(fā)達國家的嚴重醫(yī)療負擔。最近的一項調查顯示，如果老年性

5、白內障的發(fā)病時間推遲10年，白內障手術的次數將減少45%。因此，一些學者認為通過預防白內障或延緩其發(fā)展來征服白內障已經成為一個全球性的社會和社會經濟問題。13，但目前我們對老年性白內障的發(fā)病機制還不是很清楚。多年來，許多學者已經證實晶狀體上皮細胞在老年性白內障的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但對其進一步的基因調控卻知之甚少。如果從與老年性白內障晶狀體上皮細胞變化相關的基因入手，研究基因的生物學功能，就有可能掌握導致白內障發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。因此，本研究擬利用改良消減雜交和基因芯片技術的準確性、全面性和快速性，以晶狀體上皮細胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內障的所有差異表達基因，然后篩選出白內障相關

6、基因，并重點研究其功能，從基因水平闡明白內障的發(fā)病機制，為白內障的防治提供新的思路和理論依據。國內外現狀分析中存在一些問題：文獻綜述不足，對國內外現狀缺乏真正的了解，提出的問題已被他人解決-低水平重復。不熟悉研究方法，簡單移植或夸大其功能，缺乏實際應用的可行性，無法達到預期目標。-現有方法和掌握這些方法的人的結合；該方法的理論可行性和實踐可行性的結合。國內外現狀簡單羅列，缺乏歸納分析，缺乏邏輯性和針對性，總結和表達不足。寫作方法：關注這個應用程序的主題。1.從疾病的角度，簡要論述了國內外的研究成果，并介紹了當前的研究熱點方向。2.從研究方向出發(fā)，詳細分析了國內外在該方向的研究進展，引出了闡明疾

7、病發(fā)病機理或發(fā)明新的治療方法等關鍵問題。3.圍繞關鍵問題，詳細討論了國內外以往的研究成果、現狀和未來發(fā)展趨勢。經過綜合分析，提出了尚未解決的問題。16、4。介紹和分析擬采用的技術方法。應簡要介紹成熟的方法，重點介紹可應用于本研究的基礎。應詳細介紹新方法的原理，并闡明可用于本研究的理論基礎和實驗基礎。需要特別注意的問題：項目中使用的技術方法的原理、過程和實際應用中可能出現的問題必須非常清楚，不能簡單移植。例如，單鏈抗體的功能基團在理論上是可以融合的，但存在“表達載體的活性、選擇和純化”等問題。5.提出本項目的研究思路。17.白內障的防治必須著眼于其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年來，國內外學者從不同角度探討

8、了白內障的發(fā)病機制。就致病環(huán)境因素而言，氧化因素、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度的變化以及某些生長因子和細胞因子的變化都與老年性白內障的發(fā)生有關。就研究部位而言，晶狀體皮質和核的蛋白質變化以及晶狀體纖維的變化與白內障的形成有關，而位于晶狀體前囊下單層的晶狀體上皮細胞在白內障形成中的變化更引人關注。由于晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一具有有絲分裂活性且數量相對穩(wěn)定的細胞，因此它們分裂并分化為晶狀體成纖維細胞，并產生晶體蛋白，該晶體蛋白永不停止生長并形成晶狀體的均勻對稱結構，這在保持晶狀體的透明度方面起著重要作用。此外，晶狀體上皮細胞在晶狀體早期也受到外部刺激的影響。研究證實，老年性白內障的晶狀

9、體上皮細胞也發(fā)生變性，細胞膜通透性增加，胞內酶活性改變，細胞數量減少體外實驗也證實了多種因素(H2O2、紫外線B、晶體蛋白自身抗體)誘導的晶狀體上皮損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)。因此，從晶狀體上皮細胞的變化探討白內障的病因，有可能把握揭示白內障發(fā)病機理的主要環(huán)節(jié)。晶體上皮細胞變化的基因調控機制是問題的關鍵，也是有待進一步研究的問題。白內障的形成與晶狀體老化密切相關，是晶狀體老化的極端表現。晶狀體老化是多種因素相互作用的結果，包括基因和非基因隨機變化的積累，以及組織特異性基因表達的程序化和非隨機變化。目前，國內外對白內障相關基因的研究主要包括以下三個方面：21。首先，研究晶狀體白內障模型和體外培養(yǎng)

10、的上皮細胞。晶狀體上皮細胞是紫外線輻射誘發(fā)白內障的主要靶細胞，其鈉鉀三磷酸腺苷酶活性和蛋白質合成與分泌增加。上皮細胞凋亡增加，其中c-fos基因表達增加；還有組蛋白H4和H3的低表達和蛋白酶、肌動蛋白和肌動蛋白基因9-12的高表達。Carper等13利用逆轉錄聚合酶鏈式反應差異顯示技術研究H2O2誘導的晶狀體上皮細胞基因差異表達。結果表明，轉谷氨酰胺酶基因表達降低，核蛋白、選擇性剪接因子2和-三羥基異丁酰輔酶a水解酶基因表達增加。第二是利用轉基因動物的研究。含波形蛋白基因和雜交中間纖維蛋白基因的轉基因小鼠出現白內障，且白內障隨著小鼠年齡的增長而加重。晶狀體改變的共同特征是晶狀體成纖維細胞的分化

11、受到抑制。14，15。龔等16報道晶狀體中含有3(3)連接蛋白基因的敲除小鼠在晶狀體形成和成纖維細胞分化的早期不受影響，隨后出現與晶狀體蛋白水解有關的核性白內障。盡管體外實驗和白內障轉基因小鼠表明一些基因變化與白內障有關，但沒有進一步的報道表明這些基因是否與老年性白內障的形成有關。三是對人老年性白內障晶狀體上皮細胞的研究。對Lee17的逆轉錄聚合酶鏈反應研究表明，前極性白內障和核性白內障上皮細胞中纖維連接蛋白、型膠原纖維、平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF型受體和結締組織生長因子的基因表達存在差異?？蔡亓_等人18使用逆轉錄聚合酶鏈反應-二磷酸脫氫酶研究了老年性白內障和正常晶狀體上皮細胞

12、之間的基因差異表達。初步結果表明，老年性白內障有3個高表達基因和12個低表達基因。然而，就雙向聚合酶鏈反應技術而言，在實驗中很難解決假陰性、假陽性和克隆全長基因的問題。以上三項研究均取得了不同程度的研究成果，但由于當時技術條件的限制，白內障相關基因及其功能無法完全闡明。發(fā)現白內障過程中晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞之間差異表達的基因可能揭示白內障的發(fā)病機制。消減雜交是尋找差異表達基因的經典方法，但實驗操作復雜。改進的抑制消減雜交(SSH)是Diatchenko等人在1996年建立的一種方法，它簡化了實驗操作，但仍存在許多問題。我校生物化學教研室建立了改良的消減雜交技術19和20，其特點是簡

13、單、方便、能獲得靶細胞特異表達的全長基因和有效分離低豐度基因。26，該方法的創(chuàng)始人從人牙髓細胞脂多糖刺激前后的差異表達基因中克隆了脂多糖刺激后特異性表達的基因，其中5個為新基因。同樣，該方法可以快速有效地獲得白內障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞之間的差異表達基因，并克隆到全長cDNA中，為進一步的結構和功能研究奠定了基礎。隨著基因芯片技術的出現，檢測差異表達基因和未知分子變得更快、更準確、更有效?；蛐酒窃?996年提出并發(fā)展起來的。這項技術將數千個脫氧核糖核酸探針集中在一個1厘米見方的基底上?；趬A基互補的原理，DNA探針中已知的堿基序列與待測的未知DNA分子雜交，然后用標記分子標記該

14、雜交體。通過自動讀取設備分析雜交結果，從而可以對檢測到的基因進行定性、定量和結構分析，以確定未知的DNA分子。由于目前還沒有現成的用于白內障研究的基因芯片，根據本研究的需要，我們建立了所有差異表達基因的cDNA文庫，然后利用基因芯片技術制備基因芯片，從而在多個樣本中檢測白內障晶體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞差異表達的潛在原因，進一步篩選出可能含有已知基因或未知基因的白內障特異性基因。通過以上兩種技術的有機結合，我們可以更快速、有效、準確地獲得白內障相關基因。綜上所述，分子生物學技術的發(fā)展為研究白內障發(fā)育過程中的功能基因和特異性調控基因提供了有利的武器。本項目從晶狀體上皮細胞入手，通過改良消減雜

15、交和基因芯片技術系統(tǒng)研究白內障相關基因，利用體外培養(yǎng)細胞和體內晶狀體上皮細胞的基因轉染，探討其在晶狀體上皮細胞變化和白內障形成中的作用，以期闡明白內障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學機制，為白內障的防治提供新的思路和理論依據。注意事項，注意邏輯和層次，隨時提問。文字應該精心制作以避免虛偽。參考資料必須提供作者的全名和來源。必須引用2002年甚至2003年的參考文獻。應注意參考國內知名專家的作品。文獻綜述不能回避國內外的最新研究進展。研究方案，1 .研究目標存在的問題：寫作要求過大：目標有限，與研究內容相對應，如：探索問題、理清關系、揭示規(guī)律、理清原則(機制)、確立方法等。32歲。研究目的：篩選老年性白內障相關基因，明確部分。研究內容：存在問題：內容太多，難以完成一個研究周期；內容零散，研究目標不明確。寫作要求：內容應適當，以確保研究周期的完成；目標互補，服務于研究目標。長度應適中，并注意與技術路線的差異。確定研究目標和內容的依據：回答科學問題；根據研究周期和資助強度。研究內容：(1)白內障相關基因的篩選：利用改進的消減雜交技術，獲得了人老年性白內障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞的差異表達基因片段，并建立了cDNA文庫。制備差異表達基因的基因芯片，利用基因芯片技術從多份標本的老年性白內障晶狀體上皮細胞中篩選出白內障相關基因