1、基因的表達(dá)與調(diào)控（上）原核生物的基因調(diào)控,一、緒論,原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測的環(huán)境中，食物供應(yīng)毫無保障，只有能根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì)，使代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。,假如在大腸桿菌內(nèi)，平均一個基因1000bp，一個細(xì)胞中約有2500-3000個基因。正常情況下，可帶有107個蛋白質(zhì)，平均每個基因產(chǎn)生3000多個蛋白質(zhì)分子。 但實(shí)驗(yàn)卻表明，每細(xì)胞中有些蛋白質(zhì)少之10個分子，而有一些卻多達(dá)500000個分子。,一個大腸桿菌中只有15個分子的半乳糖苷酶，若將細(xì)胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每細(xì)胞中酶量可高達(dá)幾萬個分子，其合成的速度和總量隨環(huán)境的變

2、化而改變。 表明基因的表達(dá)受到調(diào)控。,細(xì)菌在進(jìn)行調(diào)控時： 一個體系在需要時被打開，不需要時被關(guān)閉。這種“開-關(guān)”（on-off）活性是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調(diào)節(jié)的。,1、基因表達(dá)及基因表達(dá)調(diào)控 是指生物體基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄及翻譯等一系列過程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定生物學(xué)功能的全過程,稱為基因表達(dá)（gene expression）。 對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控（gene regulation或gene control）。,基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個方面： 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulatio

3、n)； mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)； 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA)。,2、基因表達(dá)調(diào)控的基本原理 多級調(diào)控:主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 四個基本的調(diào)控點(diǎn)： 基因的結(jié)構(gòu)活化 轉(zhuǎn)錄起始：最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié) 轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn) 翻譯及翻譯后加工,3、基因表達(dá)的調(diào)控方式 負(fù)調(diào)控（negative transcription regulation）: 調(diào)控蛋白+DNA序列 基因表達(dá)(相應(yīng)蛋白質(zhì)降低) 正調(diào)控（positive transcription regulatio

4、n）: 調(diào)控蛋白+DNA序列 基因表達(dá) (相應(yīng)蛋白質(zhì)增加),負(fù)調(diào)控,根據(jù)作用特征,負(fù)控誘導(dǎo),負(fù)控阻遏,正調(diào)控,根據(jù)作用特征,正控誘導(dǎo),正控阻遏,正調(diào)控與負(fù)調(diào)控并非互相排斥的兩種機(jī)制，而是生物體適應(yīng)環(huán)境的需要，有的系統(tǒng)既有正調(diào)控又有負(fù)調(diào)控；原核生物以負(fù)調(diào)控為主，真核生物以正調(diào)控為主；降解代謝途徑中既有正調(diào)控又有負(fù)調(diào)控；合成代謝途徑中一般以負(fù)調(diào)控來控制產(chǎn)物自身的合成。,主要環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄，起始因子決定RNA聚合酶識別特異性。,操縱子（operon）： 原核生物中幾個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇串聯(lián)排列組成的一個基因表達(dá)的協(xié)同單位（DNA序列）。 一個操縱子 編碼序列（2-6）+啟動序列+操縱序列+(其他調(diào)節(jié)

5、序列),二、原核基因調(diào)節(jié)特點(diǎn),1、乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)： 葡萄糖充分時： 葡萄糖代謝有關(guān)的酶基因-表達(dá) 其他糖代謝有關(guān)的酶基因-關(guān)閉 葡萄糖耗盡時,乳糖存在： 乳糖代謝有關(guān)的酶基因 -表達(dá) 葡萄糖代謝有關(guān)的酶基因-關(guān)閉 說明酶可以誘導(dǎo),一）乳糖操縱子(lactose operon),乳糖的利用及其相關(guān)的酶: 乳糖 (在通透酶作用下進(jìn)入細(xì)菌） 別位乳糖 葡萄糖+半乳糖,半乳糖苷酶,乳糖的利用,半乳糖苷酶,乳糖確實(shí)可誘導(dǎo)Lac mRNA的合成,能以乳糖作為唯一碳源和能源生長的定為lac+；相反，稱之為lac-。,安慰誘導(dǎo)物（gratuitous inducer）,誘導(dǎo)物的加入和去除對lac mRNA的

6、影響,2、結(jié)構(gòu)基因順序 乳糖操縱子包括三個結(jié)構(gòu)基因：Z、Y、A,P,Y,Z,A,O,轉(zhuǎn)錄方向,A 模型的提出,1940年，Monod發(fā)現(xiàn)細(xì)菌“二次生長曲線”； 1950年，Monod和Tacob發(fā)現(xiàn)兩對基因Z和I； Szilard發(fā)現(xiàn)I基因決定阻遏物的合成； Jocob提出結(jié)構(gòu)基因旁邊還有開關(guān)基因，即操縱基因。,J.Lederberg 1948 不同Lac-突變型 細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn) 證明三基因緊密連鎖,B 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 結(jié)構(gòu)基因,Lac Z-Y+A+：- 半乳糖苷酶基因突變,Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。 -半乳糖苷酶是一種-半乳糖苷鍵的專一性酶，

7、除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 -半乳糖苷透過酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 -半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,在這些突變體中，有一類突變體，它體內(nèi)的半乳糖苷酶的形成不依賴于誘導(dǎo)物的存在，即沒有乳糖或別的半乳糖苷存在時也能合成- 半乳糖苷酶，這種突變體稱為組成型突變。分為兩類：I型和O型。 I型：野生型為I+，突變型為I-； O型：野生型為O+，突變型為Oc。,調(diào)節(jié)基因,I+I-或O+ Oc后，Z、Y、A結(jié)構(gòu)基因均表現(xiàn)為永久表達(dá)，所以I基因被稱為

8、調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)。 I基因是一個產(chǎn)生阻遏物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉。I-突變體由于不能產(chǎn)生阻遏物，使細(xì)胞成為lac永久表達(dá)型。I-/I+局部二倍體由于帶有一個正常阻遏物，使細(xì)胞中的lac仍然被抑制。, I 型組成型突變,Hfr lac I+Z+strST6S,F- lac I-Z-strrT6r,培養(yǎng)無誘導(dǎo)物,混合培養(yǎng),1小時后加入抗生素 殺死供體菌,- 半乳糖苷酶活性逐漸上升,2小時后 加誘導(dǎo)物,組成型變?yōu)檎T導(dǎo)型,說明： I+合成特異的阻遏物，無誘導(dǎo)物時可阻止Z基 因表達(dá) 誘導(dǎo)物可作為阻遏物的拮抗物，使阻遏物失活， Z基因表達(dá) I-不產(chǎn)生無活性阻遏物，因而無需誘

9、導(dǎo)物，Z基 因就可表達(dá)，阻遏物起負(fù)調(diào)控作用,I基因產(chǎn)物及其功能,1967年 W.Gilbert 和B.Miller Hill將 lac I+ 或lac I- E.coli細(xì)胞提取物分別與放 射性標(biāo)記的IPTG混合，發(fā)現(xiàn)lac I+ E.coli細(xì)胞 提取物中有某種蛋白質(zhì)可以與IPTG結(jié)合，且每 個蛋白分子可以與4個IPTG分子結(jié)合，而lac I- E.coli細(xì)胞提取物中沒有這種蛋白質(zhì)與IPTG結(jié) 合，說明與IPTG結(jié)合的蛋白是I基因的產(chǎn)物。,lac I+ 的離體反應(yīng)液（35S標(biāo)記的I基因的產(chǎn)物）與不同的DNA分子相互作用，發(fā)現(xiàn)I基因的產(chǎn)物 不與失去lac操縱子全部基因的DNA分子結(jié)合 在有I

10、PTG時不與lac操縱子基因結(jié)合 不與lacOC突變體的DNA分子結(jié)合 說明 I基因的產(chǎn)物有兩個結(jié)合位點(diǎn),阻遏蛋白: N端: 159aa頭部片段：為HTH，與操縱基因DNA的大溝結(jié)合； 核心區(qū)：有6個折疊，誘導(dǎo)物就結(jié)合在兩個核心區(qū)之間的裂縫中； C端: 為兩組亮氨酸拉鏈，形成四聚體。,活性阻遏蛋白的另一個重要特點(diǎn)是形成四聚體 等位基因間的互補(bǔ)（interallelic complementation）,不同等位基因編碼的亞基可相互締合形成雜合多聚體， 其性質(zhì)不同于任何一種純合多聚體。,Uninducible lacI S mutations are dominant,Constitutive

11、lacI d mutations are dominant,組成型 表達(dá),不可 誘導(dǎo),Lac阻遏物 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 調(diào)控機(jī)制 （負(fù)調(diào)控）,由基因I編碼生成的蛋白質(zhì) 具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì) 具有4個相同亞基，每個亞基中都有一 與誘導(dǎo)劑和O基因結(jié)合的位點(diǎn) Lac阻遏物與O基因結(jié)合： 結(jié)構(gòu)基因關(guān)閉 Lac阻遏物與誘導(dǎo)劑結(jié)合： 不與O基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因開放 RNA聚合酶結(jié)合，轉(zhuǎn)錄開始, Lac阻遏物,I,O,O,誘導(dǎo)劑,乳糖操縱子的負(fù)調(diào)控,O+Z+ - OcZ+ OcZ+/O+Z+ OcZ/OZ+ OcZ+/OZ ,基 因 型,組成表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá),操縱基因 O基因組成型突變,說明： Oc對O+顯性，但只對其臨

12、近的基因才有作 用，稱為順式顯性。,順式顯性（cis-dominant)：顯性效應(yīng)只對處于同一染色體上它所調(diào)控的結(jié)構(gòu)基因才起作用的現(xiàn)象,遺傳學(xué)圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表DNA鏈上的一個位點(diǎn)或一個非編碼區(qū)域，而不是一個基因，因?yàn)榭删幋a的基因具有互補(bǔ)性，而Oc沒有這一特性。 O決定相鄰Z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是組成型合成，O區(qū)域稱為操縱基因。,操縱基因的結(jié)構(gòu),特點(diǎn)：-7-+28，以+11為對稱軸 典型特征具有反向重復(fù)序列 相互作用位點(diǎn)可以縮小在+5-+17,I,P,O,Z,Y,A,調(diào)控基因

13、 控制位點(diǎn) 結(jié)構(gòu)基因,DNA,阻遏蛋白,啟動序列,cAMP-CAP結(jié)合位點(diǎn),操縱序列,半乳糖苷酶,通透酶,乙?；D(zhuǎn)移酶,3、乳糖操縱子（lactose opron） 結(jié)構(gòu),RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),（6759）,（728）,General organization of the lac operon of wild-type E. coli. Order of controlling elements and genes: lacI:promoter-lacI-terminator operon:promoter-operator-lacZ-lacY-lacA-terminator,-54 -5

14、8 -65 -69,-47 -8,-3 +21,AUG：+39 +41,-47 -84,1）P-O區(qū) Promotor: -84-+ 1 Operator: -7-+28 兩者有7bp重疊，使這段序列可能無法同時結(jié)合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能雖然可以同時結(jié)合，但無法形成開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,2）Lac阻遏物的作用-負(fù)調(diào)控,沒有乳糖存在時,Lac阻遏物的作用-負(fù)調(diào)控,有乳糖存在時,3）誘導(dǎo)物的作用機(jī)制 a誘導(dǎo)模式 平衡模型（間接作用）：DNA結(jié)合的阻遏蛋白和游離的阻遏蛋白迅速平衡，加入誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)物結(jié)合到游離的阻遏蛋白上，打破了平衡，從而導(dǎo)致結(jié)合的阻遏蛋白釋放,阻遏蛋白從操縱基因上解離下來

15、的速率非常低以至不能和平衡模型相吻合。,b 解離模型（直接作用）：誘導(dǎo)物直接和結(jié)合在操縱基因上的阻遏蛋白相互作用。可能通過改變其構(gòu)象使其離開操縱基因。,4）兩個矛盾,第一個誘導(dǎo)物如何進(jìn)入細(xì)胞？ 第一個-半乳糖苷酶如何產(chǎn)生？ 解釋： 本底水平表達(dá),在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量（1-5個mRNA分子）lac mRNA合成。由于阻遏物的結(jié)合并不是絕對緊密，即使在與操縱基因緊密結(jié)合時，也會偶爾掉下來，這時啟動子的阻礙被解除，RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致在非誘導(dǎo)情況下少量透過酶可以合成。 mRNA的這種合成稱為本底水平表達(dá)。,5）CAP-cAMP復(fù)合物在乳糖操縱子表達(dá)中 的作用-乳糖操縱子的正調(diào)控,1965年，

16、Sutherland 發(fā)現(xiàn)大腸桿菌培養(yǎng)液中葡萄糖的含量總是與cAMP含量成反比。 1968年，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌培養(yǎng)液中加入cAMP可增加半乳糖苷酶的產(chǎn)量。,葡萄糖消耗完,Adenylate cyclase converts ATP into cAMP. Phosphodiesterase converts cAMP to AMP. Glucose catabolite may inhibit adenylate cyclase and stimulate Phosphodiesterase, cAMP的作用： 刺激多種可誘導(dǎo)的操縱子。 cAMP和CRP結(jié)合后發(fā)揮作用。 CRP（分解物基因激活物蛋白

17、）：由Crp基因編碼，有二個相同亞基的蛋白質(zhì)。其中一個與DNA結(jié)合的domain， 一個與cAMP結(jié)合的domain。 CRP和cAMP結(jié)合后,稱為CAP，刺激操縱子,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄(正調(diào)控)。,CAP （catabolite activator protein）以兩種方法來激活轉(zhuǎn)錄： （1）它可能直接和RNA Pol相互作用； （2） 作用于DNA，改變其結(jié)構(gòu)，從而幫 助RNA Pol結(jié)合。,葡萄糖 cAMP Lac操縱子被抑制,無葡萄糖，cAMP濃度高時,有葡萄糖，cAMP濃度低時,cAMP-CAP與DNA相結(jié)合，造成雙螺旋彎曲，形成一個“環(huán)狀”結(jié)構(gòu)， lacI+基因產(chǎn)物（阻遏物）無法與

18、O區(qū)相結(jié)合，易于形成三元轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，只要有這個“環(huán)”的亞基存在，lac operon就可以得到表達(dá)。 cAMP-CAP還能直接影響RNA聚合酶的活性。,6）乳糖操縱子基因表達(dá)的一般情況,基因表達(dá)的外界信號 基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控 基因表達(dá)的正調(diào)控 正、負(fù)調(diào)控協(xié)同表達(dá),葡萄糖、乳糖濃度的變化 Lac阻遏物與操縱基因 cAMP+CAP與相應(yīng)的DNA序列,條件2:,低乳糖,條件3:,低乳糖,條件4: 高葡萄糖 低cAMP 高乳糖,Lac 阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時, CAP對該系統(tǒng)不發(fā)揮作用,條件1: 低葡萄糖 高cAMP 高乳糖,Lac 阻遏蛋白不封閉轉(zhuǎn)錄時, 沒有CAP存在,也無高效轉(zhuǎn)錄活性。,Lac 阻

19、遏蛋白不封閉轉(zhuǎn)錄, CAP+ cAMP 加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。,O,O,O,O,O,當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用； 如無CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時，細(xì)菌首先利用葡萄糖。葡萄糖對 lac 操縱子的阻遏作用稱分解代謝阻遏(catabolic repression)。 lac操縱子的誘導(dǎo)作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。,無乳糖時,有乳糖時,無葡萄糖 cAMP濃度高,有葡萄糖cAMP濃度低,lac操縱子基因表達(dá)既需要乳糖又需缺乏葡萄糖,色氨酸操縱子(tryptophane operon)負(fù)責(zé)色氨酸的生物合成，當(dāng)培養(yǎng)基中

20、有足夠的色氨酸時，這個操縱子自動關(guān)閉，缺乏色氨酸時操縱子被打開，trp基因表達(dá)，色氨酸或與其代謝有關(guān)的某種物質(zhì)在阻遏過程（而不是誘導(dǎo)過程）中起作用。由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調(diào)控。,二）色氨酸操縱子,色氨酸的合成分5步完成。每個環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉(zhuǎn)錄在一條多順反子mRNA上，分別以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，編碼鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。,1. 色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu), trpR(89)和trpABCDE(25)不緊

21、密連鎖； 操縱基因在啟動子內(nèi) 有衰減子(attenuator) 啟動子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連， 二者被前導(dǎo)順序(Leader)所隔開,trpE基因是第一個被翻譯的基因，與其相鄰的是前導(dǎo)區(qū)trpL和衰減子trpa。trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠(yuǎn)，后者在大腸桿菌染色體圖上25min處，而前者則位于90min處。 在位于65min處還有一個trpS（色氨酸t(yī)RNA合成酶），它和攜帶有trp的tRNATrp也參與trp操縱子的調(diào)控作用。,2.阻遏物對色氨酸操縱子的負(fù)調(diào)控-阻遏系統(tǒng),trpR基因在其自身的啟動子作用下，合成分子量47000的調(diào)控蛋白，但沒有與O結(jié)合的活性

22、，因此被稱為輔阻遏蛋白(aporepressor)，除非培養(yǎng)基中有色氨酸。 輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并使之關(guān)閉轉(zhuǎn)錄trp mRNA。,有Trp,無Trp,mRNA,O,P,trpR,調(diào)節(jié)區(qū),結(jié)構(gòu)基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,色氨酸操縱子,3.衰減作用對色氨酸操縱子的調(diào)控,前導(dǎo)區(qū)的序列特點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制 衰減機(jī)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù),前導(dǎo)區(qū)（Leader）：結(jié)構(gòu)基因起始密碼子前有162個堿基，其中的 139個堿基構(gòu)成前導(dǎo)區(qū)。 前導(dǎo)肽（Leader peptide）：推測前導(dǎo)區(qū)mRNA可編碼14個氨基酸 組成的多肽，其中第10和第11位均為色氨酸。 有四個富含GC的區(qū)段，

23、相鄰的區(qū)段之間可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。,弱化子（ attenuator ）： 一段位于結(jié)構(gòu)基因上游前導(dǎo)區(qū)，具有終止子結(jié)構(gòu)的短序列，通過前導(dǎo)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 形成類 似于終止子的二級結(jié)構(gòu)，達(dá)到轉(zhuǎn)錄終止的目的。,前導(dǎo)序列,第10、11密碼子為trp密碼子,14aa前導(dǎo)肽編碼區(qū):,包含序列1,形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)能力強(qiáng)弱： 序列1/2序列2/3序列3/4,UUUU 3,前導(dǎo)肽,前導(dǎo)mRNA,A.當(dāng)色氨酸濃度高時,1）轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制,衰減子結(jié)構(gòu) 就是終止子 可使轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶,終止,前導(dǎo)肽,前導(dǎo)mRNA,RNA聚合酶,B.當(dāng)色氨酸濃度低時,Trp合成酶系相關(guān) 結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄,序列3、4不能形成衰減子結(jié)構(gòu),L

24、ow Trp,High Trp,高Trp時： Trp-tRNATrp 存在 核糖體通過片段1(2個Trp密碼子) 封閉片段2 片段3，4形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 類似于不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止序列 RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生衰減子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,轉(zhuǎn)錄、翻譯偶聯(lián),產(chǎn)生前導(dǎo)肽,低Trp時： Trp-tRNATrp 沒有供應(yīng) 核糖體翻譯停止在片段1 （2個Trp密碼子） 片段2，3 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄不終止 RNA聚合酶繼續(xù)轉(zhuǎn)錄,2）衰減機(jī)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù),a 衰減作用的發(fā)現(xiàn) trp 操縱子受阻遏蛋白阻遏時，表達(dá)僅下降為阻遏 前的1/70，而Lac 操縱子受阻遏蛋白阻遏時，表達(dá) 下降為阻遏前的1/1000 trpS5突變株

25、溫度敏感型突變株，它所編碼的Trp-tRNAtrp合成酶 只在30時有活性，42時無酶活性。比較野生型和 突變型在42和30時Asase的酶活性，表明Trp- tRNAtrp有調(diào)節(jié)功能 trpLD102突變株 該細(xì)菌在有色氨酸的培養(yǎng)基中仍有很高的色氨酸合 成酶活性,trpED53中L不缺失（弱化子存在），trpLD102中L缺失（弱化子不存在），缺失前導(dǎo)區(qū)后的表達(dá)比有前導(dǎo)區(qū)的表達(dá)要高得多，充分說明trp操縱子的表達(dá)調(diào)控除阻遏作用外，還受到前導(dǎo)區(qū)的影響，失去了這個因素就失去了一個調(diào)控機(jī)制。,b 衰減作用的遺傳學(xué)證據(jù) trpL29突變株 增強(qiáng)終止突變型 前導(dǎo)區(qū)29位核苷酸GA，使AUGAUA tr

26、pL75突變株 增強(qiáng)終止突變型 前導(dǎo)區(qū)75位核苷酸GA,減弱了2區(qū)和3區(qū)形成莖環(huán)能力 trpL29 trpL131GC雙突變株 trpL29 trpLC1419雙突變株 解除終止,Trp的存在對終止轉(zhuǎn)錄是有效的，弱化子僅允許約10%的RNA聚合酶通過。 缺乏Trp時，弱化子允許所有的聚合酶通過。,3)其他氨基酸饑餓對Trp衰減子的影響, 當(dāng)所有的氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢， 結(jié)果有利于1+2和 3+4發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，于是RNA pol停止 轉(zhuǎn)錄。 大多數(shù)其他氨基酸的缺乏， 核糖體停止運(yùn)轉(zhuǎn)的位置可讓1區(qū)和2區(qū)配對，并不影響3區(qū)和4 區(qū)形成終止子結(jié)構(gòu)，所以trp基因不表達(dá) 當(dāng)Gly

27、饑餓時， 1區(qū)和2區(qū)中可形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)，不影響3區(qū)和4區(qū) 當(dāng)Thr饑餓時， 影響1區(qū)/2區(qū)和2區(qū)/3區(qū)配對。但不影響3區(qū)和4區(qū)配對 當(dāng)Arg饑餓時， 影響1區(qū)/2區(qū)配對，但不影響2區(qū)/3區(qū)配對， 3區(qū)和4區(qū)不配對,4）協(xié)調(diào),阻遏作用：粗調(diào)開關(guān) 阻遏物的作用是當(dāng)有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟(jì)。阻遏作用的信號是細(xì)胞內(nèi)色氨酸的多少。 弱化作用：細(xì)調(diào)開關(guān) 弱化作用的信號是Trp-tRNAtrp的多少，通過控制前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行,依靠弱化作用，色氨酸的存在就使色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄被抑制了10倍。與色氨酸阻抑物的作用 (70倍)合在一起，這就意味

28、著色氨酸水平對色氨酸操縱子的表達(dá)施加了700倍的調(diào)節(jié)效果。,有實(shí)驗(yàn)證明，在不加色氨酸的培養(yǎng)基中，trp mRNA的合成仍然受到部分阻遏，現(xiàn)在一般認(rèn)為，野生型細(xì)胞中同時存在著有活性和無活性的阻遏物，培養(yǎng)基中色氨酸濃度的變化，能夠使這兩種阻遏物間的平衡發(fā)生傾斜，最終做出關(guān)閉或啟動trp操縱子的決定，從而維持一定的色氨酸含量。,5）原核生物衰減作用的普遍性,三）半乳糖操縱子(galactose operon),包括3個結(jié)構(gòu)基因： 異構(gòu)酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)， 半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶(galactose transferase, galT)， 半乳糖激酶

29、(galactose kinase, galK)。 這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。GalR（調(diào)節(jié)基因）與galE、T、K及操縱區(qū)O等離得很遠(yuǎn)，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。,A gal操縱子的特點(diǎn)： 它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄； 它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67-53，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。,兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)S1和S2。 從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時，才能順利進(jìn)行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CAP和較高濃度的c

30、AMP。從S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始，當(dāng)無cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S2開始。,B 雙啟動子的功能 半乳糖不僅可以碳源供細(xì)胞生長，而且尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細(xì)胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構(gòu)酶（galE ）的作用由UDP-葡萄糖合成的。生長過程中的所有時間里細(xì)胞必須能夠合成差向異構(gòu)酶。,葡萄糖存在時 cAMP缺少 S1不能啟動 S2啟動轉(zhuǎn)錄,半乳糖存在時 cAMP濃度升高 S1啟動轉(zhuǎn)錄 S2啟動受抑制,結(jié)果：在兩種不同的環(huán)境里都可以

31、形成細(xì)胞壁物質(zhì)的前體,阿拉伯糖(arabinose) 是可作為碳源的五碳糖。 參與阿拉伯糖代謝酶的基因分布于不同操縱子中，但由一個調(diào)節(jié)基因（araC）的產(chǎn)物調(diào)控。,四）阿拉伯糖操縱子（ arabinose operon）,1、基因組成 結(jié)構(gòu)基因：araA、araB和araD 分別編碼L阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖激酶和L核酮糖5磷酸4差向異構(gòu)酶。 調(diào)節(jié)基因：araC 操縱基因：O1、O2 基因E、F：負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖進(jìn)入細(xì)胞,araC基因位于另一個操縱子中，它編碼的araC蛋白是操縱子的調(diào)控因子。,araBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進(jìn)行的。,AraC的結(jié)構(gòu)： AraC由29

32、2aa殘基組成，其N端結(jié)構(gòu)域(1-170aa) 可結(jié)合阿拉伯糖并參與形成二聚體，C端（178-292aa) 為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。AraC對araBAD的調(diào)控包括正、負(fù)調(diào)控兩種方式。 araBAD上有三個AraC結(jié)合位點(diǎn)：araO1（-106-144）、araO2(-265-294和位于araBAD啟動子的araI位點(diǎn)。araI位點(diǎn)為兩個“半位點(diǎn)”(-56-78和-35-51)。araO1 在araBAD表達(dá)調(diào)控中的作用較小。,2、調(diào)節(jié)機(jī)制,調(diào)節(jié)蛋白AraC的作用 第一，它調(diào)節(jié)它自己的生物合成。 當(dāng)AraC水平較低時，其基因從Pc開始表達(dá)。當(dāng)AraC蛋白濃度高時，由于AraC與AraO1結(jié)合，而

33、araO1與AraC基因的啟動子重疊，可阻遏araC基因的表達(dá)。,第二，它對araBAD既是負(fù)的調(diào)節(jié)子也是正的調(diào)節(jié)子(regulator)，它既能結(jié)合于araO2又能結(jié)合于araI。通過兩種異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)：Pr（阻遏作用）；Pi（誘導(dǎo)作用）。 負(fù)調(diào)控 當(dāng)cAMP水平較低且缺乏阿拉伯糖時，AraC二聚體結(jié)合在araO2和araI1半位點(diǎn)使DNA成環(huán)，阻遏araBAD的表達(dá)。,正調(diào)控 當(dāng)Ara存在而無葡萄糖時，Ara與AraC蛋白結(jié)合使其構(gòu)象改變而釋放araO2，此時AraC結(jié)合在araI1和araI2處。同時由于cAMP的積累激活CRP，活化的CRP結(jié)合在位于araO1和araI間的CRP位點(diǎn)。 a

34、raC+Ara和CRP共同作用可激活RNA pol轉(zhuǎn)錄araBAD。因此，AraC具有正、負(fù)調(diào)控的雙重作用。 由于Ara+araC結(jié)合在araO1處使araC不能表達(dá)。,但當(dāng)同時有葡萄糖和Ara時，由于cAMP不能激活CRP，araBAD則不表達(dá)，同時araC也不表達(dá)。,3、小結(jié) AraC蛋白是雙功能的，單純的C蛋白結(jié)合于araO1(-100-144)，起到阻遏的作用；當(dāng)C蛋白和誘導(dǎo)物Ara結(jié)合形成的復(fù)合體時是Cind蛋白（ind是induction的縮寫），即誘導(dǎo)型的C蛋白，它結(jié)合于araI區(qū)（-40-78）使RNA 聚合酶結(jié)合于PBAD位點(diǎn)（+140），轉(zhuǎn)錄B、A、D三個基因； C蛋白結(jié)合

35、araO1時也反饋性地阻遏了其本身的表達(dá)； C蛋白的兩種狀態(tài)（Cind和Crep）功能不同，結(jié)合的位點(diǎn)也不同。Cind結(jié)合于araI；Crep可結(jié)合于araO1和araO2； ara操縱子的C蛋白還可以調(diào)節(jié)分散的基因araE和F，因此此轉(zhuǎn)錄單位也稱調(diào)節(jié)子（regulon）； 本操縱子有兩個啟動子Pc和PBAD，可以雙向轉(zhuǎn)錄； Pc啟動子和araO1重疊。,五） DNA重排對基因表達(dá)的調(diào)節(jié),鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimrium） ： 鞭毛蛋白亞基的合成由2個非等位基因控制而出現(xiàn)兩相性(diphasic)。 鞭毛抗原有兩種（H1和H2），單個細(xì)菌只有一種鞭毛抗原，但同一菌落既可以表現(xiàn)為H1型，

36、也可以表現(xiàn)為H2型。 在細(xì)菌的分裂中有1/1000的概率會出現(xiàn)由一相轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪幌?，稱為相轉(zhuǎn)變（phase variation） 。, H1和H2是由兩個非等位基因編碼，位于不同的染色體座位。 H2基因與抑制H1轉(zhuǎn)錄的阻遏物基因（rhl）緊密連鎖 H2基因的上游有995bp的片斷（兩側(cè)為反向重復(fù)序列，右反向重復(fù)序列上游16bp處含有H2基因的啟動子，中間含有倒位蛋白基因）可以倒位，一旦發(fā)生倒位，則H2和rh1無法轉(zhuǎn)錄,Phase 1,在沙門氏菌鞭毛合成中，通過改變啟動子的方向來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)： 2相：H2與rhl基因同時表達(dá)，且阻止H1基因的表達(dá)； 1相：H2與rhl基因都不表達(dá)，H1基因進(jìn)行表達(dá)。,

37、六） RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始對基因表達(dá)的調(diào)控,1、因子的替換-級聯(lián)調(diào)控,早期, 從一套基因的轉(zhuǎn)錄到另一套基因的表達(dá)是噬菌體感染的共同特點(diǎn)。 通過噬菌體編碼的RNAPol的合成來完成。,正常營養(yǎng)生長期中，枯草桿菌因子為43或A （分子量為43KD），與大腸桿菌的RNA聚合酶相似，2。,因子更換用于噬菌體基因表達(dá)時序的控制 早期基因轉(zhuǎn)錄：2 43（宿主），gp28基因表達(dá) 中期基因轉(zhuǎn)錄：2 gp28，gp33和gp34基因表達(dá) 晚期基因轉(zhuǎn)錄：2 gp33gp34,因子更換意義 亞基更換后只識別新的一類基因 導(dǎo)致RNA聚合酶活性改變,幾乎大部分的因子轉(zhuǎn)換都發(fā)生在孢子形成中。 孢子的形成涉及到生物合成活

38、性的劇烈變化，這些變化和很多基因有關(guān)。 營養(yǎng)時期的基因被關(guān)閉，孢子形成的特異基因表達(dá)。,2 43 SpoOA（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物）,F表達(dá),中隔形成前,2 43 H,E 表達(dá),前孢子中： 2 F： 第一套孢子形成基因表達(dá)（G，信號蛋白） 2 G： 轉(zhuǎn)錄孢子形成晚期基因,母細(xì)胞中： 2 E： 母細(xì)胞中基因表達(dá)（K） 2 K： 母細(xì)胞中晚期基因表達(dá),孢子形成是由兩種級聯(lián)調(diào)控控制的，在級聯(lián)調(diào)控中每一間隔部分的都相繼被激活，每個因子指導(dǎo)一套特殊的基因合成蛋白質(zhì)。 當(dāng)一種新的因子被激活，原來的因子被取代，這樣通過轉(zhuǎn)移因子來打開基因或關(guān)閉基因。,2、修飾核心酶替換亞基,T4噬菌體的時序調(diào)節(jié)依賴本身攜帶的蛋白對宿主

39、的核心酶加以修飾,改變其和亞基的結(jié)合能力,乘機(jī)將本身編碼的蛋白取代原來的亞基,從而改變RNA聚合酶的識別能力。, T4噬菌體在生活周期的不同階段合成不同的mRNA。 早期轉(zhuǎn)錄mRNA：編碼有關(guān)DNA合成、RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、重組等的酶 晚期轉(zhuǎn)錄mRNA：編碼噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白及與粒子裝配和裂解宿主等有關(guān)的基因。 內(nèi)部蛋白：T4的頭部含有幾種小分子蛋白，可伴隨著 DNA一道注入到細(xì)菌中. ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶（ADPRT）（內(nèi)部蛋白）：將ADP-核糖（ADPR）連接到宿主RNA聚合酶的亞基上的精氨酸胍基上使其被修飾,內(nèi)部蛋白伴隨著DNA一道注入到細(xì)菌中，包括ADPRT； 利用宿主的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄第一批

40、早期mRNA； ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶（ADPRT）將ADP-核糖（ADPR）連接到 宿主RNA聚合酶的亞基上的精氨酸胍基上使其被修飾 ，降低了RNA核心酶與因子的結(jié)合能力，而增加了其 與T4噬菌體編碼的蛋白Mot的親和力， Mot蛋白取代了亞基，使新的RNA聚合酶不再識別寄主 的基因和T4早期基因的啟動子，而能識別下一批基因的 啟動子。 到轉(zhuǎn)錄晚期同時，RNA聚合酶被進(jìn)一步地修飾，其兩個 亞基各結(jié)合了一個ADPR分子及4個修飾性蛋白，稱其 為超修飾（hupermodified）的RNA聚合酶。,基本步驟,3、 RNA聚合酶的代換,T7噬菌體根據(jù)自身的感染特點(diǎn)而采用RNA聚合酶的代換方式來進(jìn)行時序

41、調(diào)控。 T7是E.coli的烈性噬菌體，基因組長為39,936nt，可能具有55個基因，其中44個基因的產(chǎn)物已鑒別.,早期轉(zhuǎn)錄：在感染后的前6分鐘，使用了宿主E.coli的RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄的基因主要有10個。0.3基因編碼宿主限制酶的抑制蛋白，使T7進(jìn)入宿主免遭降解；0.7基因編碼一種蛋白激酶，能將E.coli的RNA聚合酶磷酸化，為抑制宿主RNA Pol作準(zhǔn)備；基因1編碼T7 RNA Pol聚合酶，它所識別的啟動子是由23bp組成的保守順序（-1716）。,晚期轉(zhuǎn)錄分為二組（和） 感染后612分鐘后T7就利用自己的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄第組基因。 其中基因2的產(chǎn)物是E.coli聚合酶抑制劑，最終

42、廢除了宿主RNA聚合酶的功能，而將自己編碼的RNA聚合酶取而代之。 感染12分鐘后表達(dá) 組基因。此轉(zhuǎn)錄物約含15個基因，它們主要編碼頭部蛋白，尾部蛋白以及負(fù)責(zé)裝配，這樣使得T7噬菌體不至于過早地裝配成粒子。,七） 翻譯調(diào)控,1、翻譯起始的調(diào)控 SD序列與AUG的距離：4-10為佳，9最佳 mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的調(diào)控,A 基因,A 基因,cp 基因,lys 基因,Rep 基因,Rep 基因,cp 基因,A轉(zhuǎn)錄一個順反子需要二級結(jié)構(gòu)的改變，而這種二級結(jié)構(gòu)的改變依賴于前一個順反子的翻譯,B 翻譯阻遏對起始的調(diào)控,Q噬菌體的復(fù)制酶可結(jié)合于SD順序 阻斷核糖體在mRNA上的移動，抑制了翻譯,C 重

43、疊基因?qū)Ψg起始的調(diào)控,D 核糖體蛋白是自身合成的轉(zhuǎn)錄抑制子,大腸桿菌的核糖體中含有50多種蛋白，各種核糖體蛋白在體內(nèi)的量是平衡的，它們與rRNA組裝成核糖體。 核糖體蛋白的基因組合成數(shù)個操縱子，每一個操縱子都包含多至11個核糖體蛋白基因（某些與其合成與生長速度耦聯(lián)的非核糖體蛋白也包括在這些操縱子中，包括RNA聚合酶的亞基、）。 與其他操縱子一樣，這些操縱子在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。,在核糖體組裝時，與rRNA結(jié)合的蛋白為關(guān)鍵蛋白，它對核糖體蛋白的合成起調(diào)控作用。 每一個操縱子編碼自己的關(guān)鍵蛋白，它抑制整個操縱子的表達(dá)。,某種r蛋白合成過快時，r蛋白可與其模板mRNA上的SD序列結(jié)合，而使其不能與核

44、糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解而使這種r蛋白合成速度降低。,與關(guān)鍵蛋白結(jié)合的rRNA和關(guān)鍵蛋白的mRNA有相似性。當(dāng)核糖體蛋白的mRNA表達(dá)過量時，關(guān)鍵蛋白較多地與核糖體蛋白的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致其不能與rRNA結(jié)合形成核糖體。這樣就可調(diào)控核糖體蛋白的合成。,E 核糖體開關(guān)（Riboswitch） 調(diào)節(jié)性的RNA 成分，它們通過直接探測到小分子代謝物，控制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而起作用。 有些核糖核酸開關(guān)對轉(zhuǎn)錄終止起作用，有些則在翻譯水平上來控制形成的RNA結(jié)構(gòu)，阻礙核糖體與mRNA 的結(jié)合.,蛋白或與蛋白緊密相關(guān)的代謝物，與mRNA上的riboswitch結(jié)合并改變riboswitch的空間結(jié)構(gòu)，阻止核

45、糖體繼續(xù)讀取編碼蛋白的mRNA片段。 比如，當(dāng)焦磷酸硫胺素（TPP）與大腸桿菌thiM riboswitch結(jié)合后，核糖體識別的mRNA片段（TPP的閱讀起點(diǎn)）被掩蓋起來。,F 反義RNA（ antisenseRNA）的調(diào)控,反義RNA（ antisenseRNA）： 能與mRNA互補(bǔ)結(jié)合，從而阻斷mRNA翻譯的RNA分子 反義基因： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的基因 可調(diào)控原核細(xì)胞中基因表達(dá)、控制噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)以及抑制轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)位作用等。 在真核細(xì)胞中也存在反義RNA，但功能尚不全部明了。,反義RNA的作用機(jī)制 反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和（或）編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制或與靶

46、mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對RNase的敏感性增加，使其降解。 反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機(jī)制可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結(jié)合后阻止了核糖體的結(jié)合。,反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。 反義RNA和mRNA有不完全的互補(bǔ)序列，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在mRNA上緊隨雜交區(qū)之后的是一段U豐富區(qū)。其結(jié)構(gòu)類似于終止子結(jié)構(gòu)，從而使轉(zhuǎn)錄開始不久后即終止。,E.coli中有兩種外膜蛋白（OmpC和OmpF）和OmpB基因座（OmpR和envZ）與滲透壓應(yīng)答有關(guān) 高滲透壓時OmpC產(chǎn)量增加，OmpF產(chǎn)量受到控制； 低滲透

47、壓時omF產(chǎn)量增加， OmpC產(chǎn)量受到控制序列分析發(fā)現(xiàn)OmpC基因上游存在另一個轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄形成的RNA可與OmpFmRNA翻譯起始區(qū)部分互補(bǔ),干擾mRNA作用的互補(bǔ)RNA （mic-RNA, mRNA-interfering complementary RNA ）,ompF基因有ompR產(chǎn)物的高親和位點(diǎn) ompC基因有ompR產(chǎn)物的低親和位點(diǎn) 低滲透壓時，ompR基因產(chǎn)物少，只結(jié)合高親和位點(diǎn)，ompF基因表達(dá)量升高；高滲透壓時，ompR基因產(chǎn)物多，可結(jié)合低親和位點(diǎn)，與ompC基因結(jié)合，雙向轉(zhuǎn)錄，促使ompC基因表達(dá)量升高外，反向轉(zhuǎn)錄生成micFRNA可與ompF的mRNA結(jié)合，阻礙翻譯。,2、翻譯延長的調(diào)控 A 稀有密碼子：在基因中利用頻率很低的密碼子 細(xì)胞可通過翻譯，調(diào)控不同蛋白含量的高低。即使對于同一操縱子上不同的基因，其產(chǎn)物在數(shù)量上也可大不相同。,許多調(diào)控蛋白在細(xì)胞內(nèi)含量很低，編碼這些蛋白的基因中高頻率地使用了很多稀有密碼子，稀有密碼子對應(yīng)低豐度的tRNA，因此，翻譯速度受tRNA供應(yīng)的限制，影響了蛋白質(zhì)合成的總量。 而其它基因中利用這些稀有密碼子頻率很低。,B 二級結(jié)構(gòu)對翻譯延伸的調(diào)控,紅霉素能與核糖體大亞基的23S rR