1、.,SSR分析的原理及操作技術(shù),.,DNA分子標(biāo)記技術(shù)類型,以Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)： 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP） 以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：隨機(jī)引物PCR標(biāo)記和特異引物PCR標(biāo)記 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD） 擴(kuò)增的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（AFLP） 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP） 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）或簡(jiǎn)單序列長度多態(tài)性（SSLP） 以mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)： 差異顯示（DD） 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR） 以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)： 單核苷酸多態(tài)性（SNP）,.,SSR簡(jiǎn)介,在生物的基因組中，特別是高等生物的基因組中含有大量

2、的重復(fù)序列， 根據(jù)重復(fù)序列在基因組中的分布形式可分為： 串聯(lián)重復(fù)序列（Tandemly repeated sequences） 分散重復(fù)序列（Interspersed repeated sequences） 依據(jù)重復(fù)基序的長度、拷貝數(shù)和位置等又將串聯(lián) 重復(fù)序列分為： 衛(wèi)星DNA：基序（motif）長10300bp，甚至長1,000100,000bp； 小衛(wèi)星DNA：基序長1060bp； 微衛(wèi)星DNA：基序長16bp，其功能：重組熱點(diǎn)、對(duì)基因的調(diào)節(jié)和表達(dá)以及性別決定等。,.,SSR簡(jiǎn)介,微衛(wèi)星DNA即簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）， 或者微衛(wèi)星序列（micr

3、osatellite，MS）， 又稱短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeats，STR）， 是一類由幾個(gè)核苷酸（多為24個(gè)）為基本單位多次串聯(lián)重復(fù)而形成的DNA片段，其長度一般較短，多在200bp以內(nèi)。 微衛(wèi)星在植物基因組中的含量非常豐富，均勻分布于整個(gè)植物基因組中，但不同植物中微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率變化非常大，但（AT）n最多。,.,SSR標(biāo)記的基本原理,盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組中的不同位置，但某一特定的微衛(wèi)星的兩端側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，將重復(fù)序列及其兩側(cè)的DNA片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，然后根據(jù)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過PCR技術(shù)將目的微衛(wèi)星DNA片段擴(kuò)增出

4、來。,.,SSR標(biāo)記的基本原理,由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單元在數(shù)量上的不同，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在長度上發(fā)生變化，即產(chǎn)生長度多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為簡(jiǎn)單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一擴(kuò)增位點(diǎn)就代表了該位點(diǎn)的一對(duì)等位基因。 SSR標(biāo)記的多態(tài)性主要依賴于基本單位重復(fù)次數(shù)的變異，而這種變異在生物群體中是大量存在的，因此，SSR具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富。,.,.,.,PCR技術(shù)的基本原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是利用單鏈寡核苷酸引物對(duì)特異DNA片段進(jìn)行體外快速擴(kuò)增的一種方法。

5、 特點(diǎn)一：使特定的DNA片段得到了迅速大量的擴(kuò)增，理論上的最高值達(dá)2n-2； 特點(diǎn)二：能夠指導(dǎo)特定DNA片段的合成。 如何實(shí)現(xiàn)？,.,.,.,PCR反應(yīng)體系,一對(duì)特異引物： 1.引物長度：典型的引物長度為18-24bp，引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性。但是長度大于24bp的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量； 2.引物濃度：一般0.1-0.5 mol/L，過高的引物濃度會(huì)加劇錯(cuò)配發(fā)生，特異性下降； 3.合理的G/C含量：一般為4060。,.,PCR反應(yīng)體系,Mg2溶液 ：其濃度直接影響引物退火的特異性、產(chǎn)物特異性以及

6、酶的催化能力和準(zhǔn)確性等，適當(dāng)降低Mg2濃度可增加特異性。 模板DNA：一般1ng/1L，模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加； dNTP ：常用濃度為50-200mol/L，種dNTP濃度應(yīng)相等，濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。 Taq酶 ：DNA聚合酶，熱穩(wěn)定，最適溫度72 ，酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 10buffer緩沖液（不含Mg2 ）：維持PCR pH的穩(wěn)定。,.,PCR循環(huán)條件,高溫變性：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈； 低溫退火：在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)； 退火溫度針對(duì)不同的引物差別較大，退火溫度過低，極易形成非特異擴(kuò)增，而退火溫

7、度過高，又難以擴(kuò)增出條帶，對(duì)于長度為20bp，GC含量為50的核苷酸的典型引物，55 是比較適宜的退火溫度。 適溫延伸：在適宜溫度下Taq DNA酶催化引物沿著模板DNA延伸。,.,PCR條件優(yōu)化,優(yōu)化引物設(shè)計(jì)：這是最關(guān)鍵的，可以借助計(jì)算機(jī)來輔助設(shè)計(jì)引物。 熱啟動(dòng)技術(shù)：在PCR反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)中待溫度升高且超過模板Tm值（80）后，再加入關(guān)鍵試劑如Taq DNA聚合酶等。這樣操作可以減少非特異性擴(kuò)增。 創(chuàng)造一個(gè)有利于增加特異性擴(kuò)增的條件：如降低Mg2，dNTP濃度，優(yōu)化pH及減少Taq酶的用量，減少循環(huán)中各部分的時(shí)間或循環(huán)數(shù)，提高退火溫度等。,.,電泳原理,在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖磷酸骨架中

8、的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的。當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)中時(shí)，他們就會(huì)向正電極的方向遷移。 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率較快。,.,電泳介質(zhì),瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點(diǎn)： 分辨率極高，可分開長度僅相差0.1的DNA分子，即 1000bp中相差1bp； 從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可用于要求最高的實(shí)驗(yàn)。,.,聚丙烯酰胺凝膠,聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N,N,N,N一四甲基乙二胺)和過硫酸銨的作用下，聚合形成

9、線狀長鏈，在交聯(lián)劑如N,N-甲叉雙丙烯酰胺參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成三維帶狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。 這些網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。,.,.,聚丙烯酰胺凝膠,變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈DNA片斷的分離與純化。這些凝膠在尿素或甲酰胺等抑制核酸堿基配對(duì)的試劑的存在下發(fā)生聚合。變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈DNA片段的分離和純化。雙鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率通常與其大小的常用對(duì)數(shù)值成反比。然而，電泳遷移率也受其堿基組成和序列的影響，因此，大小完全相同的兩條DNA的遷移率

10、可相差10。非變性聚丙烯酰胺凝膠主要用于制備高純度的DNA片段和檢測(cè)蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物。,.,用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通常PCR產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離效果優(yōu)于非變性膠。因?yàn)殡s合個(gè)體在PCR后期的循環(huán)中會(huì)產(chǎn)生異源雙鏈分子，導(dǎo)致在雜合的情況下膠中產(chǎn)生了3條帶甚至是4條帶，而不是正常的2條帶。這種情況出現(xiàn)會(huì)干擾等位基因的統(tǒng)計(jì)。,.,染色方法與原理,溴化乙錠（EB）染色法：但是聚丙烯酰胺對(duì)熒光燃料溴化乙錠的熒光有猝滅作用，EB染色法很難檢測(cè)到少于10ng的DNA條帶。 銀染法（硝酸銀）：是一種檢測(cè)微量DNA的理想方法。 優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速、靈敏，無污染、分辨率高、結(jié)果可永

11、久保存 原理：銀染液中的銀離子(Ag+)可與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛在堿性條件下使Ag+還原成銀顆粒，可把DNA電泳帶染色成黑褐色,.,載樣緩沖液（loading buffer）,指示劑（溴酚藍(lán)或二甲苯氰）一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400等組成載樣緩沖液，加入到擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物當(dāng)中。 作用： 1.增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。 2.形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。 3.使樣品呈色，使加樣操作更方便。,.,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,1.實(shí)驗(yàn)材料 馬貴荔（母本）焦核三月紅（父本）F1雜種群體中部分個(gè)體的基因組DNA溶液。每人做4個(gè)模板。 一對(duì)特異

12、引物： B-F09 F：5TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3 B-F09 R：5CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3,.,2.配制SSR擴(kuò)增的反應(yīng)液：,各組份的用量及終濃度如下表，做多個(gè)反應(yīng)時(shí)，可將所用的的相同組份一次取樣、混勻后再分裝至各個(gè)反應(yīng)中。,.,3.SSR-PCR,配制好反應(yīng)液后，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 3min（預(yù)變性）； 94 50s55 50s7250s（35個(gè)循環(huán)）； 72 10min（延伸反應(yīng)）,.,4.制備5的變性聚丙烯酰胺凝膠：,將長、短玻璃板固定在制膠板上，用1.0的瓊脂糖封口，將配好的膠溶液沿玻璃板點(diǎn)樣端小心灌入，排除氣泡，待膠灌滿后插入梳子，靜置1h，讓其聚合凝固。,.,5.電泳樣品的準(zhǔn)備：在PCR產(chǎn)物中加入8L的load