1、生物大分子分離純化 原理與技術(shù),內(nèi)容提要,1、層析原理與技術(shù) 2、凝膠過濾層析 3、UNOsphere離子交換分離技術(shù) 4、CHT陶瓷羥基磷灰石分離技術(shù) 5、疏水相互作用與親和層析,Life is based on proteins and their interactions,層析原理與操作,層析的起源和原理,起源-1906年，俄國植物學(xué)家Tsweet 原理-利用物質(zhì)分配系數(shù)不同達(dá)到分離 目的,原理與操作,Chromatography,層析,色譜,什么是生物層析,根據(jù)生物分子物理化學(xué)特性的不同而達(dá)到分離 極性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP

2、 離子特性：ionic characteristics (charge) IEX 大小與形狀：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 結(jié)構(gòu)特征與活性位點(diǎn)：shape (ligand binding, affinity) AC 這些特性的區(qū)別使不同蛋白質(zhì)分子在層析的固定相和流動相的分配不同而達(dá)到分離,原理與操作,Gel Filtration 凝膠過濾,Ion Exchange 離子交換,Hydrophobic Interaction 疏水層析 反相,Affinity 親和層析,CHT 羥基磷灰石,原理與操作,最廣泛的蛋白質(zhì)分離純化方法 條件溫和 維持蛋白質(zhì)

3、空間結(jié)構(gòu)與活性 基于蛋白質(zhì)對固定相的不同保留達(dá)到分離 蛋白質(zhì)溶于流動相中，經(jīng)過裝填固定相的柱子分離,層析原理與操作,層析的5個操作步驟,裝柱并平衡 上樣 平衡 洗脫 再生,上樣,裝填有層析介質(zhì)的層析柱,分離,分離組分流出,原理與操作,層析圖,原理與操作,第一峰, 外水體積, Vo, 不與柱中填料相互作用直接從柱中流出。這是樣品中的未結(jié)合物質(zhì),Vo,Ve,Vt,蛋白質(zhì)含量 (A280), 由UV檢測器讀出，y軸,基線,洗脫峰，有些可以很好的分離，有些分得不是很好，有部分交叉,有時這里也顯示梯度濃度等檢測值,時間或體積，x軸,純化平臺的硬件結(jié)構(gòu) 層析工作站 層析介質(zhì)和層析柱,原理與操作,層析系統(tǒng),

4、DuoFlow中高壓層析系統(tǒng),LP低壓層析系統(tǒng),Profinia全自動親和層析系統(tǒng),手動層析組件,DuoFlow中高壓層析系統(tǒng),主要特點(diǎn)： 3500psi高壓力下梯度模式最大流速可達(dá)20ml/min 連續(xù)波長，4波長同步檢測 方形X、Y軸組分收集器 軟件直觀容易使用,BioLogic LP 低壓層析系統(tǒng),LP Data View 軟件,BioLogic LP 系統(tǒng),BioFrac 方形組分收集器,主要特點(diǎn)： 流速精確，0.01ml/min 檢測靈敏度更高, 0.001AU 兼容方形收集器,Profinia 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng),主要特點(diǎn)： 全自動親和純化，包括親和標(biāo)簽、親和無標(biāo)簽，抗體等純化 雙紫外

5、檢測器設(shè)計 純化與脫鹽串聯(lián)一步完成 結(jié)果直接報告目標(biāo)蛋白的濃度和得率,為什么在層析技術(shù)中要使用層析儀,介質(zhì)的要求 實(shí)驗的精密度和重現(xiàn)性要求 時間的要求,純化平臺的硬件結(jié)構(gòu),層析介質(zhì)與層析柱，原理與技術(shù),層析介質(zhì),離子交換層析介質(zhì) Unosphere Q，S MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM 親和層析 Profinity IMAC金屬螯合介質(zhì) Profinity Epoxide環(huán)氧親和介質(zhì) Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel藍(lán)膠，DEAE藍(lán)膠，CM藍(lán)膠 Affi-Prep多粘菌素介質(zhì) Affi-Gel硼膠

6、 Affi-Gel配體固定化活化介質(zhì),凝膠過濾層析介質(zhì) Bio-Gel P系列 Bio-Beads S-X介質(zhì) 羥基磷灰石介質(zhì)（CHT） 氟代羥基磷灰石介質(zhì)（CFT） 疏水層析介質(zhì) Macro-Prep Methyl HIC Macro-Prep t-Butyl HIC Bio-Beads SM-2吸附劑,層析柱,分析柱 離子交換分析柱：Uno Q, S Aminex分析柱分析單糖、寡糖、有機(jī)酸、有機(jī)堿，以及肽和核酸有機(jī)小分子 羥基磷灰石分析柱：Bio-Scale CHT-I 凝膠過濾分析柱：Bio-Sil, Bio-Silect HPLC 分析柱 反相層析分析柱：Hi-Pore RP304,

7、 Hi-Pore RP318,各種層析介質(zhì)的Cartridges用于條件摸索 UNOsphere MacroPrep CHT HIC,層析介質(zhì)結(jié)構(gòu)原理,Unosphere MacroPrep,離子交換層析 Q，S，DEAE，CM,疏水層析 -CH3, t-Butyl,親和層析 Protein A IDANi 多粘菌素,凝膠過濾 CHT和CFT,Unosphere Q, S MacroPrep High Q, S MacroPrep DEAE, CM,MacroPrep Methyl HIC MacroPrep t-Butyl HIC,Profinity IMAC Profinity Epoxi

8、de Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel, DEAE, CM Affi-Prep Polymixin Affi-Gel硼膠 Affi-Gel配體固定化活化,層析介質(zhì)及其技術(shù),凝膠過濾層析 離子交換層析 羥基磷灰石層析 疏水層析 親和層析,1. Spherical particles packed into a column,2. Sample applied,3.Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of ma

9、trix,4. large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass straight through.,凝膠過濾,凝膠過濾層析,分離純化原理,A good gel for gel filtration contains about 95% water,凝膠結(jié)構(gòu),Steric exclusion leads to early elution,按照分子量大小洗脫 大分子首先洗脫，最小的分子在

10、最后面洗脫,100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100,1,800,800,4,000,1,000,6,000，用于脫鹽,1,500,20,000,2,500,40,000,3,000,60,000,5,000,100,000,100,凝膠過濾層析,凝膠的選擇,Bio-Gel P4(800-4,000) for separation digested products from IgG,凝膠過濾層析,凝膠的選擇,凝膠過濾層析,

11、Bio-Gel P6(1000-6000),凝膠的選擇,凝膠過濾層析,Bio-Gel P10(1500-20,000),凝膠的選擇,凝膠過濾層析,Bio-Scale Mini Bio-Gel P6脫鹽預(yù)裝柱,操作方便，可連接在DuoFlow、LP、Profinia和Econo泵上,Bio-Beads S-X介質(zhì) 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球體,Bio-Beads S-X1,Bio-Beads S-X3,600,Bio-Beads S-X8,1,000,Bio-Beads S-X12,400,高分辨率親脂性分子排阻色譜,2,000,14,000,中草藥和天然產(chǎn)物活性成分分離純化 高分辨率，快速純化酯

12、類、芳香族，多環(huán)、雜環(huán)化合物,介質(zhì)可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有機(jī)溶劑,凝膠過濾層析,1、三硬脂酸甘油酯，891 2、三肉豆蔻酸甘油酯，729 3、三月桂酸甘油酯，645 4、三辛酸甘油酯，477 5、三己酸甘油酯，393 6、十六烷，226 7、十一烷，156,Bio-Beads S-X8分離效果,高分辨率親脂性分子排阻色譜Bio-Beads S-X介質(zhì),凝膠過濾層析,柱長的選擇 分離：30120cm 脫鹽：30cm以下 洗脫液 離子強(qiáng)度,pH中性 流速，根據(jù)層析介質(zhì)的說明，一般很低 樣品容量：13CV,凝膠過濾層析,操作參數(shù)選擇,增加分

13、辨率的方法,檢測柱效 檢測分離度 減少上樣體積 降低流速 使用更小的介質(zhì)顆粒的介質(zhì) 連接2根層析柱,1.可分離相對分子量從幾百到幾十萬的物質(zhì) 具有3000個理論塔板的凝膠過濾可將分子量相差2倍的蛋白質(zhì)完全分開,6000個理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質(zhì)完全分開;建議柱高在80-120cm,直徑=H/30 2.脫鹽,凝膠過濾層析,凝膠過濾層析的應(yīng)用,凝膠過濾層析,凝膠過濾層析的特點(diǎn)：,層析柱規(guī)模很大，實(shí)驗室1.0-2.530-100cm，工藝1020200cm，從而設(shè)備成本很高； 上樣體積少，必須少于柱床體積的3才能達(dá)到較好的分離效果，如果大體積樣品必須濃縮，從而造成樣品的損失和增大工藝

14、的復(fù)雜性； 工藝時間（生產(chǎn)周期）長，甚至24小時或以上； 分辨率低； 不需摸索純化條件，按照分子量區(qū)帶分離,因此，往往用分子篩分離時只適用于純化的最后一步去熱原，或離子 交換上樣前的脫鹽,離子交換層析,離子交換層析類型及其選擇,-O-CH2CH2-NH+,C2H5,C2H5,-N+(CH3)3,-O-CH2-C-O-,O,-SO3-,pI,stability range,stability range,與陽離子交換介質(zhì)結(jié)合,+,-,denaturation,denaturation,pH,10,2,離子交換層析,離子交換層析原理蛋白質(zhì)滴定曲線,蛋白質(zhì)凈電荷,與陰離子交換介質(zhì)結(jié)合,Product

15、s: UNOsphere Q PCHT due to aggregate removal,Three Step Platform Purification, conditions,Elute protein A with 0.1M glycine, 0.05M NaCl, pH 2.5 (no citrate or EDTA). Raise pH to 3.8 by addition of 1M Tris pH 8.5, 4.9% v:v. Hold for viral inactivation (see reference) Raise pH to 7.0 by addition of 1M

16、 Tris pH 8.5, 2.3% v:v. This will yield a conductivity of 9mS. Equilibrate UNOsphere Q column to 0.07M Tris, 0.1M glycine, pH 7.0, flow-through mode Reduce pH to 6.5 by addition of 0.5M monobasic NaPO4 (pH 4.1), 1% v:v. Equilibrate CHT with 5mM NaPO4, pH 6.5 Load, wash, 20 CV linear gradient to 1.5M

17、 NaCl* Clean with 0.5M NaPO4 *screening conditions, increase to 10mM if IgG does not elute,3-Step Platform purification, summary,UNOsphere SUPrA,CHT,UNOsphere Q,4,1,2,3,1,2,3,4,5,2,4,5,0,S,HPSEC Bio-Silect SEC 400-5 50mM HEPES 0.5M NaCl 2M urea, pH 7,3 Step-Platform Purification, summary,Aggregate r

18、emoval by CHT More than 99% reduction by HPSEC Leached protein A removal by CHT 90% removal by Cygnus ELISA reduced from 55 to 5 ng/mL DNA removal by CHT 3 logs reduction by PCR reduced to 1ng/mL by picogreen Endotoxin removal by CHT Spiked with LPS from E.coli, Salmonella, and P. aeruginosa removed

19、 7 x 104 EU by LAL final concentration, IgG pool, 1EU/mL,基于生物分子表面疏水性不同而達(dá)到分離的技術(shù) 疏水作用來自于分子的水化結(jié)構(gòu)，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子外表面，從而可與疏水介質(zhì)結(jié)合 不同離子的疏水性 Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN- Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ 蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結(jié)合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫,原理,疏水層析,MacroPrep Methyl HIC MacroPrep t-Butyl

20、HIC,產(chǎn)品,疏水層析,生物分子表面大都有或強(qiáng)或弱的疏水區(qū)域，在不同環(huán)境下，與各種疏水介質(zhì)產(chǎn)生不同強(qiáng)弱的結(jié)合 高離子強(qiáng)度可加強(qiáng)疏水性 跟離子交換相反，高鹽吸附，低鹽洗脫；洗脫樣品又 可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱，作為連接層析 步驟的橋梁，取代鹽析沉淀技術(shù) 比反相層析的配體密度低很多，無須有機(jī)溶劑洗脫， 保存生物活性 配體種類繁多，很難預(yù)測哪一種、哪一個條件最適合 ，可用疏水層析試盒選擇介質(zhì),作用原理,溶質(zhì),曝露在外的疏水基,配基,水分子,大量水分子,DG = DH - T DS,為什么使用疏水層析?,離子交換技術(shù)、羥基磷灰石、凝膠過濾技術(shù)、親和層析技術(shù)的補(bǔ)充 溫和，非變性條件純化 互補(bǔ)的選

21、擇性 高收率 濃縮技術(shù),操作參數(shù)選擇,疏水層析,疏水介質(zhì)選擇：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白質(zhì)：丁基，苯基 鹽：硫酸銨，醋酸銨等等 緩沖體系和pH 洗脫梯度,Sample: GFP sample brought up to 2 M AS, filtered Load:5 ml Buffer: A:2 M (NH4)2SO4+ 0.1 M NaP, pH 7 B: 0.1 M NaP, pH 7 Flow Rate:3 ml/min (230 cm/hr),Macro-Prep 甲基疏水,苯基疏水,20% EtOH,疏水層析,Profinity IMAC純化H

22、is-tagged Protein Chelex 100純化DNA，PCR樣品制備 Affi-Gel Protein A純化單克隆抗體 Dye - Affi-Gel Blue (DEAE or CM) 純化單抗，分離HSA Affi-Gel 肝素凝膠多種蛋白，如凝結(jié)因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶 Affi-Gel Polymixin去除內(nèi)毒素（熱原） Affi-Gel 硼膠分離核苷酸、核苷、兒茶酚胺、糖類等小分子,親和層析,產(chǎn)品與應(yīng)用,Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution,Equili

23、brate the column and the sample to binding conditions.,親和層析,親和層析,Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution,Apply sample under binding conditions.,親和層析,Equilibration Sample application Binding and washing Desorption and elution,Change the eluent to elute the target.,Profinity IMAC Resins,固定化金屬螯合層析：Immobilized Metal Affinity Chromatography （IMAC）,基于純化重組組氨酸標(biāo)記蛋白設(shè)計，專門純化His-tagged Protein 螯合帶電離子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+, 現(xiàn)有的產(chǎn)品