1、實(shí)驗(yàn)三、細(xì)菌的革蘭氏染色和顯微鏡油鏡的使用,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解并掌握油鏡的原理和使用方法； 掌握細(xì)菌革蘭氏染色的原理和方法，學(xué)會(huì)在油鏡下觀察細(xì)胞和識(shí)別細(xì)菌的形態(tài)特征。,二、實(shí)驗(yàn)材料 1、菌種：大腸桿菌、葡萄球菌 2、儀器：顯微鏡 3、染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液、Lugol碘液、95乙醇、0.5%沙黃染色液 4、材料：載玻片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙,三、實(shí)驗(yàn)原理,（一）普通光學(xué)顯微鏡（p.21-23） 1.光學(xué)部分:接目鏡 、 接物鏡 、 照明裝置(聚光鏡、 虹彩光圈、 反光鏡等)。 它使檢視物放大,造成物象。 2.機(jī)械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器

2、等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。,圖1-1-2 光學(xué)顯微鏡的成像原理,1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù) 2. 顯微鏡的分辨率 是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為： D=0.61/nSin/2 式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。 ：可見光的波長（平均0.55m) n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 ：鏡口角（即入射角）。,顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率,D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰,（二）油鏡使用的原理 油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中

3、間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。,根據(jù)公式D=0.61/nSin/2 ，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。,1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。 2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度 3.觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 4.拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 5.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。,（三）顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng),1、實(shí)驗(yàn)原理（p

4、.29） 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中重要的鑒別染色法。 有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)； 弧菌、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。,（四）、革蘭氏染色原理及操作,經(jīng)典法，四步法（p.29-31）,2、實(shí)驗(yàn)操作,p.30，采用三區(qū)涂片法,大腸桿菌,葡萄球菌,（1）涂片：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚,（2）固定： 染色前必須固定細(xì)菌，其目的是： 一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上。 二是增加其對(duì)染料的親和力。常用加熱固定法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。,注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會(huì)改變甚至破壞

5、細(xì)胞形態(tài)。,（3）染色（先閱讀p.31的注意事項(xiàng)） 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是整個(gè)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。 染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)摔去細(xì)胞上的殘水，以免染色液被稀釋。,（4）鏡檢(p.24，用低倍、高倍、油鏡分別觀察細(xì)菌) 以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。,（5）顯微鏡用畢后的處理（p.25） 油鏡使用完畢后一定要用二甲苯擦拭鏡頭，但二甲苯量不可過多！,本實(shí)驗(yàn)每人做一張。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告中要畫圖表示結(jié)果（低倍、高倍、油鏡）。,3、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,實(shí)驗(yàn)思考題（回答在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上）,1.涂片為何要固定？固定加熱時(shí)間過長會(huì)怎樣 2.使用