1、分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作、設(shè)計(jì)與技能,質(zhì)粒提取技巧及常見(jiàn)問(wèn)題分析 李剛 副教授,質(zhì)粒提取技巧及常見(jiàn)問(wèn)題分析,堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒，是從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室每天都要用的常規(guī)技術(shù)。可是許多人卻對(duì)堿法質(zhì)粒抽提的原理知之甚少。追其原因，大概是因?yàn)榉肿涌寺±锩嬷恢v實(shí)驗(yàn)操作步驟，而沒(méi)有對(duì)原理進(jìn)行詳細(xì)的論述。本次課將告訴大家常見(jiàn)的幾種質(zhì)粒提取的方法、原理、步驟及其技巧，并對(duì)質(zhì)粒提取過(guò)程中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行分析。,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所需基本工具,高效菌株： DH10B，Top10, DH5,XL-1 blue,HB101，BL21 （E.coli）;芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿

2、菌等）；酵母（畢赤酵母、釀酒酵母、乳酸克魯維酵母）等。 各種基因：基因一般位于各種載體（如克隆載體pUC18 和表達(dá)載體pET32等）上。 生化試劑：一般多為分析純，少數(shù)為化學(xué)純。 水：最好的是超純水，其次為三(雙)蒸水，最差為去離子水，一般很少用自來(lái)水。 高效酶類(lèi)：限制酶，修飾酶，連接酶，Taq酶，pfu等。 經(jīng)典的分子生物學(xué)工具書(shū)：分子克隆（目前出到第三版），精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南（目前出到第五版）等。 各種儀器設(shè)備：離心機(jī)、培養(yǎng)箱、PCR儀、滅菌鍋等；,作者：美J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯 出 版 社：科學(xué)出版社 出版時(shí)間：2008-12-1 版次：3 頁(yè)數(shù)：1949 定價(jià)：￥168.

3、00,本書(shū)系分子克隆試驗(yàn)指南2001年初推出的第三版，是必備的工具書(shū)，被譽(yù)為生命科學(xué)領(lǐng)域中的“圣經(jīng)”。,定價(jià)：￥180.00,作者：（美）奧斯伯等主編，金由辛等譯校 出 版 社：科學(xué)出版社 出版時(shí)間：2008-5-1 版次：1頁(yè)數(shù)：1319字?jǐn)?shù)：2063000,本書(shū)是知名度很高、不斷更新的最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current Protocols in Molecular Biologyc)系列的精編版本。,基因（質(zhì)粒）的獲取,1、從本實(shí)驗(yàn)室或其它實(shí)驗(yàn)室（尤其是國(guó)外）獲得；（首選） 2、從商業(yè)公司購(gòu)買(mǎi)；（次選） 3、自己克隆。（末選） （1）RT-PCR 克?。盒枰疾牧稀?（2）合成全

4、長(zhǎng)基因：采用OE-PCR技術(shù)，不需要原始材料，價(jià)格昂貴，一般合成1kb基因約需花費(fèi)5000-6000元，3-4星期時(shí)間。 （3）自己合成寡核苷酸引物并拼接：采用OE-PCR技術(shù)，不需要原始材料，一般自己合成基因的費(fèi)用約相當(dāng)于專(zhuān)業(yè)公司合成價(jià)格的三分之一至二分之一，所需時(shí)間視個(gè)人操作技巧。,什么是質(zhì)粒？,質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外的DNA分子，其大小范圍在KB至KB以上不等。大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合的環(huán)狀分子，以超螺旋形式存在。 至少在實(shí)驗(yàn)室，大多數(shù)質(zhì)粒是通過(guò)寫(xiě)信獲取而并不需要自己動(dòng)手構(gòu)建。所有的質(zhì)粒，無(wú)論來(lái)自于商家還是科技工作者，在用于實(shí)驗(yàn)以前一定要進(jìn)行驗(yàn)證（驗(yàn)證的方法一般為酶切、電泳

5、）！,獲得基因（質(zhì)粒）后的處理方法,1、如果得到的是質(zhì)粒DNA，一般是沉淀在乙醇中的DNA，將其離心并用TE緩沖液（pH.）溶解，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行酶切鑒定和瓊脂糖電泳根據(jù)贈(zèng)予者或發(fā)表的文獻(xiàn)中所提供的圖譜，表交所觀(guān)察到的條帶的大小與預(yù)期中是否相符。 2、如果質(zhì)粒保存在細(xì)菌菌株中，通常以真空密閉的凍干粉或涂在無(wú)菌濾紙片上來(lái)郵寄。將上述菌種取少量，轉(zhuǎn)移到mL含有合適抗生素的液體培養(yǎng)基中，然后在合適溫度下劇烈振蕩小時(shí)。待液體培養(yǎng)物長(zhǎng)好后，在含合適抗生素和適當(dāng)?shù)谋匾砑游锏沫傊桥囵B(yǎng)皿中劃線(xiàn)培養(yǎng)，于合適的溫度保溫過(guò)夜。檢查皿中所有的克隆，確定其在外形和氣味上是否與大腸桿

6、菌相同（大腸桿菌一般為酸臭味，外形為規(guī)則的圓形、半透明或微透明；酵母土腥味或酒香味，致病菌不要聞?。?。然后將分離的克隆進(jìn)行小規(guī)模液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用不同的限制酶消化質(zhì)粒，并用瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)贈(zèng)予者或發(fā)表的文獻(xiàn)中所提供的圖譜，比較所觀(guān)察到的條帶的大小與預(yù)期中是否相符。 3、大腸桿菌和酵母菌株必須保存在70C冰箱中，菌種中必須含有15以上（1520）的甘油。,實(shí)驗(yàn)室常用提取質(zhì)粒的方法,1、堿法提取； 2、煮沸法提?。?3、高純提取法（Kit）； 4、堿法結(jié)合Kit制備法； 5、超快提取法（純度不高，多用于篩庫(kù)）。,堿法提取質(zhì)粒的原理,將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂

7、，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶液使堿基配對(duì)完全破壞，閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會(huì)彼此分離，因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要OH-處理的強(qiáng)度不要太過(guò)，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)，DNA雙鏈就會(huì)再次形成。在裂解過(guò)程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽（SDS）包蓋。當(dāng)用鉀離子（來(lái)自溶液3）取代鈉離子時(shí)，這些復(fù)合物就會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)。離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。,煮沸法原理,這個(gè)方法是將細(xì)菌懸浮于含有TritonX-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然后加熱到 C使其裂解。加

8、熱除了破壞細(xì)菌外壁，還有助于解開(kāi)DNA鏈的堿基配對(duì)，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是閉環(huán)質(zhì)粒DNA由于具有互相纏繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而不會(huì)分離。當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各就各位，形成超螺旋分子。離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。,試劑盒提質(zhì)粒的原理,國(guó)內(nèi)外絕大部分的質(zhì)粒抽提試劑盒使用的都是堿裂解法結(jié)合硅膠柱純化技術(shù)。首先利用堿法中的試劑裂解細(xì)胞。裂解后的細(xì)胞液加入硅膠柱中。硅膠柱中使用了一種特殊的玻璃纖維濾膜，這種濾膜在高離子溶劑（鹽酸胍，NaI, NaClO4）的條件下，可以同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)，而在低鹽條件下，核酸又可以從濾膜中釋放出來(lái)，蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會(huì)被

9、吸附，從而達(dá)到純化核酸的目的。硅膠柱將核酸抽提或純化變成一種簡(jiǎn)單的過(guò)濾操作，以取代傳統(tǒng)溶液型抽提技術(shù)的離心方式。硅膠柱的過(guò)濾吸附操作大大減少了抽提過(guò)程中離心和干燥時(shí)間，并去除耗時(shí)的醇類(lèi)沉淀過(guò)程。此外，硅膠柱還第一次提供了一種高通量的純化方式，大大加速了各種高通量篩選的科研項(xiàng)目，各種96孔板或384孔板的純化方式紛紛出現(xiàn)。至目前為止，硅膠柱已經(jīng)成為目前核酸分離純化中最主流的技術(shù)。,提質(zhì)粒方法的選擇,從經(jīng)濟(jì)的角度講，堿裂解法是首選，一般不建議用煮沸法，除非獲得質(zhì)粒的目的僅僅是初步的鑒定，而不是用于構(gòu)建載體。 堿裂解法所獲得的質(zhì)粒經(jīng)酚：氯仿純化后可滿(mǎn)足絕大多數(shù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。 試劑盒提取的質(zhì)粒

10、在純度上比堿法更好，而且更簡(jiǎn)單、快速，但比較昂貴（隨著試劑盒的規(guī)?；蛧?guó)產(chǎn)化，目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已能承受其價(jià)格）。 我們實(shí)驗(yàn)室建立的超快提質(zhì)粒法一般只適用于大量轉(zhuǎn)化子或質(zhì)粒文庫(kù)的快速篩選，一般不作為質(zhì)粒制備的方法推薦。 結(jié)合堿裂解法和試劑盒法，我發(fā)展出一種大量制備高純度質(zhì)粒的方法，將在本次課的后面介紹。,堿法質(zhì)粒抽提用到的三種溶液,溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl，pH 8.0 / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。,溶液I的配制,溶液I：50 mM葡萄糖 / 25 m

11、M Tris-Cl，pH 8.0 / 10 mM EDTA，pH 8.0； 配制：1000 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 25 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0） 20 ml 20% Glucose（1.11 M） 45 ml ddH2O 910ml 將以上溶液混合裝瓶， 15磅（121C）高壓滅菌15 min 或8磅（116C）高壓滅菌25 min，冷卻后4 保存。 注意：含葡萄糖等糖類(lèi)的培養(yǎng)基需要過(guò)濾除菌或8磅滅菌。,0.5M EDTA母液的配制,配制量：1L。 配制方法： 1稱(chēng)取186.1g Na2EDTA2H2O置于1L燒杯中。 2加入800ml的去離子水，置

12、于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢琛?3用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0（約需20g NaOH），當(dāng)pH 接近8.0時(shí)， EDTA方可完全溶解，加入去離子水 定容至1L。 4小份分裝后，高溫高壓（121C，20分鐘）滅 菌，室溫保存。,溶液II的配制,溶液II：0.2N NaOH ， 1% SDS 配制： 500 ml 10% SDS 50 ml 2N NaOH 50 ml(也可用10N NaOH稀釋) 取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存（不需滅菌）。此溶液保存時(shí)間最好不超過(guò)一個(gè)月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。 注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛?溶液III的配制,溶液 III ：3 M

13、醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。 5 M 冰醋酸。 配制：500 ml 醋酸鉀 147 g 冰醋酸 57.5 ml 加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至500 ml。高溫高壓（121C，20分鐘）滅菌后，4保存。,TE緩沖液（pH 8.0）的配制,10TE緩沖液（pH 8.0）：100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0) 。 配制：1000 ml 1 M Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0) 100 ml 500 mM EDTA (pH 8.0) 20 ml 加入約800 ml的去離子水，均勻混合

14、。溶液定容至1 L。高溫高壓（121C，20分鐘）滅菌后，4保存。,苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)的配制,量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡過(guò)的苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。 兩個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題： 1、Tris飽和的酚和水飽和的酚有什么區(qū) 別？ 2、配好的苯酚/氯仿/異戊醇為什么會(huì)分 層？應(yīng)該用上層還是下層去純化DNA？,分子生物學(xué)常用的苯酚種類(lèi),1、水飽和酚。 水飽和酚又叫水平衡酚。水飽和酚的pH小于7，通常與異硫氫酸胍一起使用，用于細(xì)胞RNA的提取，這樣DNA在酚相，RNA在水相。兩者就分開(kāi)了。2、Tris飽和酚。 一

15、般pH大于7.8，用于DNA的提取和純化。其制作過(guò)程如下： （1）冰箱取出重蒸酚，室溫放置一會(huì)，然后放入68度水浴溶化，切 勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂。（2）加8羥基喹啉至0.1和巰基乙醇至0.2，混勻，溶液呈 現(xiàn)黃色，倒入分液漏斗中（也可在燒杯中進(jìn)行）。（3）加入等體積的1M的Tris(pH8.0),反復(fù)混勻后，靜至分層；放出 下層黃色酚液，棄上層。（4）加固體Tris約1g/100ml酚，搖勻，去水相。（5）加0.1M Tris(pH 8.0)平衡數(shù)次，至pH為8.0。（6）加0.1M Tris(pH 8.0)于棕色瓶中4度保存。 注意：無(wú)論重蒸酚、水飽和酚還是Tris飽和酚現(xiàn)

16、在均可直接買(mǎi)到，不需自己制備。但不管哪種酚，如黃色消失或呈粉紅色，則不能使用。,苯酚/氯仿/異戊醇為什么會(huì)分層？,因?yàn)樗玫腡ris飽和酚中有水，而水難以與苯酚、氯仿或異戊醇混溶，所以會(huì)分成兩層。 上層是水相，下面那層淡黃色的液體是苯酚/氯仿/異戊醇的混溶液。,DNasefree RNase儲(chǔ)存溶液配制,溶解10mg的胰蛋白R(shí)NA酶于1ml的1 mM的乙酸鈉水溶液中（pH 5.2）,使終濃度為10 mgml。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。然后在室溫下緩慢冷卻后，用1 M的TrisHCl調(diào)pH至7.4，小管分裝后，置于-20貯存。（配制過(guò)程中要戴手套）。,質(zhì)粒提取中所需的其它試劑

17、,異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無(wú)水乙醇、70乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml或100mg/ml）。 100 mg/ml 氨芐青霉素的配制： 配制量：50ml。 配制方法： 1稱(chēng)取5g Ampcillin置于50ml塑料離心管中。 2加入40ml無(wú)菌去離子水，充分混合溶解之后定容至 50ml。 3用0.22m濾膜過(guò)濾除菌，小份分裝（1ml一管）后， 置于20保存。,溶液I的作用分析,讓我們先來(lái)看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)起來(lái)不可思議，加了葡萄糖后最

18、大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2 +和Mg2+ 等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可

19、不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話(huà)告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。 有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。,溶液II的作用分析,輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了

20、不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話(huà)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA

21、的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。 注意：往菌液中加入溶液II是堿法提質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟甚至是決定步驟，假如這一步失敗了，就不用繼續(xù)下面的步驟了，可以停下來(lái)準(zhǔn)備下一次質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)了。 思考題：如何判斷這一步是成功還是失敗呢？,溶液III的作用分析,每個(gè)人都知道，溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是

22、遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專(zhuān)門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上

23、結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。,細(xì)菌的收獲和裂解（1）,細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方

24、法，以取得滿(mǎn)意的結(jié)果。 (1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用溫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液50mM Tris-Cl(pH8.0), 10% (m/V 蔗糖)中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)行處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類(lèi)去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。 (2)可用普通的堿裂解法或更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線(xiàn)狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)

25、。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 (3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類(lèi)，當(dāng)隨后用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類(lèi)會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類(lèi)，而糖類(lèi)可抑制多種限制酶的活性。 故從諸如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。,細(xì)菌的收獲和裂解（2）,(4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA 株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒?/p>

26、完全滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟(用酚：氯仿進(jìn)行抽提)可以避免此問(wèn)題。 (5)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。,質(zhì)粒DNA的純化,常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小

27、及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線(xiàn)狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過(guò)嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線(xiàn)狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線(xiàn)狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和( 每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線(xiàn)狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大

28、量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。 除極少數(shù)特殊用途的質(zhì)粒純化需要用到密度梯度純化方法外，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室用途的質(zhì)粒的純化可以用質(zhì)粒純化試劑盒或聚乙二醇方法純化。,聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA,氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA一般用不到，這里不列出。聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA: (1)將核酸溶液所得轉(zhuǎn)入15mlorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。 (2）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用So

29、rvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。 (3）小心去掉上清，敞開(kāi)管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開(kāi)管口并將管倒置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 (4）用500l含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20g/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。 (5）加500l含13（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機(jī)于4以12000g離

30、心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。 (6）吸出上清，用400l TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。 (7）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100l 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。 (8）吸去上清，加200l處于4以12 000g離心2分鐘。 (9）吸去上清，敞開(kāi)管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見(jiàn)的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 10）用500l TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋用TE（pH8.0) 后測(cè)量OD 260，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度（1OD26050g質(zhì)粒DNA

31、/ml）， 然后將DNA貯于20。 如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要較純的質(zhì)粒DNA，強(qiáng)烈推薦直接用Kit提取質(zhì)粒DNA，或使用堿法抽提與質(zhì)粒提取試劑盒相結(jié)合的方法來(lái)純化質(zhì)粒。,質(zhì)粒DNA的堿裂解法小量制備（1）,（一）細(xì)菌的收獲和裂解1收獲 1）將2ml含相應(yīng)抗生素的加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于37劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。 2）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4。 3）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡

32、可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。,質(zhì)粒DNA的堿裂解法小量制備（2）,2堿裂解 1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100l用冰預(yù)冷的溶液中，劇烈振蕩。 須確使細(xì)菌沉淀在溶液中完全分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩（用Votex），可使沉淀迅速分散。 含糖培養(yǎng)基的滅菌方法： 1、8磅壓力下（116 C ）滅菌25分鐘普通培養(yǎng)基一般是15 磅壓力下（121C ）滅菌20分鐘。 2、配1M的葡萄糖母液，0.22 m口徑的過(guò)濾器過(guò)濾除菌并儲(chǔ) 存在4 C 。然后加入滅菌后的培養(yǎng)基中稀釋到終濃度。,質(zhì)粒DNA的堿裂解法小量制備（3）,2）加200l新配制的溶液。 蓋緊管

33、口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面 均與溶液接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。 3）加150l用冰預(yù)冷的溶液。 蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后 將管置于冰上35分鐘。,質(zhì)粒DNA的堿裂解法小量制備（4）,4）用微量離心機(jī)于412 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 5）可做可不做：加等量酚：氯仿， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不必用酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。 6）用2倍休積的

34、乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置2分鐘。 7）用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分鐘。 8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。 9）用1ml70%乙醇于4洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。 i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如f3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物35g。 ii如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可

35、取1l DNA溶液加到另一含8l水的微量離心管內(nèi)，加1l 10限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育12小時(shí)。將剩余的DNA貯存于20。 iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物。,質(zhì)粒DNA的煮沸法小量制備,1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350lSTET中。 STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 5% Triton X-100 2）加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮

36、作用。 3）將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。 4）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。 5）用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。 6）在上清中加入40l 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420l異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。 7）用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。 8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。 9）加1ml 70

37、乙醇，于4以12 000g離心2分鐘。 10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開(kāi)管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的液體（25）分鐘。 11）用50l含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20g/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20。 注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶的大腸桿菌株（endA 株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能完全滅活內(nèi)切核酸酶，以后在Mg2+存在下溫育時(shí)質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9）之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。,堿

38、裂解法提質(zhì)粒中常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因,堿裂解法和煮沸法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般不會(huì)遇到麻煩。但我仍然強(qiáng)烈推薦堿裂解法而一般不要用煮沸法。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用堿裂解法的過(guò)程中，只碰到過(guò)以下幾個(gè)問(wèn)題： (1)有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果問(wèn)題依然存在，可用離心柱層析法（Kit）純化DNA。 (2)在十分偶然的情況下，有些人的制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這多數(shù)情況下是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去，有時(shí)是

39、因?yàn)樵噭┡渲朴袉?wèn)題（如成分、濃度或pH錯(cuò)誤等）。(3)提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀或彌散狀(Smear狀)：操作過(guò)程中用力過(guò)猛，動(dòng)作過(guò)大或操作過(guò)程中試劑被污染。,質(zhì)粒DNA的大量堿裂解法制備,參見(jiàn)分子克隆相關(guān)章節(jié)，具體步驟此處略。 與小量制備法大同小異，基本上相當(dāng)于小量制備法的按比例放大。,堿法和試劑盒聯(lián)合大量制備質(zhì)粒DNA的方法,堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA時(shí)，質(zhì)粒中常常含有較多的雜質(zhì)，而使得質(zhì)粒無(wú)法應(yīng)用于一些對(duì)質(zhì)粒純度要求很高的后續(xù)研究中。而小量提取質(zhì)粒的試劑盒雖然提取的質(zhì)粒純度很高，但每個(gè)柱子只能提取1.5-3mL菌液中的質(zhì)粒DNA，所得到的質(zhì)粒DNA量較少（最多只有幾g），也無(wú)法滿(mǎn)足某些后續(xù)

40、研究的需要，而且也造成了試劑盒柱子中膜的DNA結(jié)合能力的浪費(fèi)（可結(jié)合多達(dá)20-30g DNA）。盡管目前已有很多公司可以提供專(zhuān)門(mén)用來(lái)大量提取質(zhì)粒的試劑盒（如QIAGEN Plasmid Maxi Kit），但這類(lèi)試劑盒常常價(jià)格較貴，而且使用次數(shù)很少（通常1-5次）。因此作者結(jié)合堿裂解法和小量提取質(zhì)粒的試劑盒，發(fā)展了一個(gè)大量制備高純度質(zhì)粒DNA的方法。,操作步驟 （1）,1、簡(jiǎn)易的堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA： （1）挑取單菌落，接種于30ml含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期（OD600=0.6）。取25ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500ml含抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37C震蕩培養(yǎng)至OD600=

41、0.4-0.8。 （2）4C，5000rpm離心10分鐘收集菌體，棄上清，加入15ml溶液I，充分重懸，加入1.5ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/mL），混勻。 （3）加入30mL新配的溶液II，顛倒離心管數(shù)次以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置10分鐘。 （4）加入20mL用冰預(yù)冷的溶液III，混勻后冰浴放置10分鐘。然后于4C，5000rpm離心15分鐘，取出上清，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘后，除去異丙醇。,操作步驟 （2）,2、接著，使用小量提取試劑盒（以QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Mini Kit為例）進(jìn)行質(zhì)粒的純化： （1）大致估計(jì)上述異丙醇沉淀得到

42、的質(zhì)粒DNA的量，并決定所使用的QIAprep Spin柱子的數(shù)量。（上述方法制備的質(zhì)粒DNA的量通常為0.5-5g/mL，視質(zhì)粒DNA的大小及性質(zhì)而異。而每個(gè)柱子中的膜可以吸附高達(dá)20-30g的質(zhì)粒DNA，為了節(jié)省柱子，并增加所提DNA的純度，通常我們用8-16個(gè)柱子吸附來(lái)自500mL菌液的質(zhì)粒DNA。而用2-4個(gè)柱子吸附來(lái)自50mL菌液的質(zhì)粒DNA。） （2）每個(gè)柱子需要使用250lBuffer P1來(lái)溶解上述的質(zhì)粒沉淀。根據(jù)柱子的數(shù)量，采用相應(yīng)數(shù)量的Buffer P1（要確保RNase A已經(jīng)被加入Buffer P1中）充分溶解異丙醇沉淀所得質(zhì)粒DNA。 （3）每250l質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)入一個(gè)

43、1.5mL的微量離心管中。 （4）每個(gè)微量離心管中再加入250l Buffer P2,并且輕輕翻轉(zhuǎn)離心管4-6次以混勻溶液。 （5） 加入350l Buffer N3,立即輕柔地翻轉(zhuǎn)離心管4-6次。 （6）室溫13000rpm離心10分鐘。 （7）小心吸出上清液，加入一個(gè)QIAprep Spin柱子中。 （8）13000rpm室溫離心1分鐘。 （9）加入750lBuffer PE到柱子中，13000rpm離心1分鐘以洗滌柱子。 （10）棄去濾過(guò)液，13000rpm再離心1分鐘以除去殘余的液體。 （11）放QIAprep柱子到一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，加入200l Buffer EB到柱子中

44、 心，室溫放置1分鐘后，以13000rpm離心1分鐘。 （12）將濾過(guò)液吸到一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，儲(chǔ)于-20冰箱中。,質(zhì)粒的超快提取法,本方法極為快速和簡(jiǎn)便，可用于從cDNA文庫(kù)或轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中高通量地篩選大量重組子，尤其適于鑒定沒(méi)有藍(lán)白斑反應(yīng)的高拷貝重組載體，例如pDNR-LIB, pPICZA等。此外，這個(gè)方法也適于從細(xì)菌培養(yǎng)物中抽提質(zhì)粒。僅僅需要兩個(gè)步驟（NaOH溶解和離心）、總共12-15分鐘就可以從12個(gè)樣品抽提出質(zhì)粒DNA。雖然該方法所制備的質(zhì)粒DNA純度較差，但在中和后仍然可以滿(mǎn)足大部分的分子生物學(xué)操作，例如酶切、連接和轉(zhuǎn)化。 實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳見(jiàn)以下這篇論文： Bingxue Do

45、ng, Lan Ouyang, Liang Qin, Gang Li*. A rapid and simple method for screening large numbers of recombinant DNA clones. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 2007, 15, 244-252.,實(shí)驗(yàn)原理,使用NaOH快速裂解細(xì)胞，離心后含有質(zhì)粒的裂解液直接用來(lái)電泳。以未連接外源DNA的質(zhì)粒作為對(duì)照，則重組質(zhì)粒由于攜帶外源DNA而在凝膠電泳的時(shí)候遷移率變慢，與對(duì)照相比在凝膠上電泳條帶中呈現(xiàn)后退。據(jù)此可判斷哪些克隆是重組質(zhì)粒。如果該方法用于提取質(zhì)粒DNA，則在NaOH裂解細(xì)胞后，需要用0.1 M HCl中和裂解液，所得質(zhì)粒D