1、革蘭氏染色法,2009年8月 一廠品控,目的要求,學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法,實驗材料,菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金 黃色葡萄球菌。 染料：草酸銨結(jié)晶紫液、革蘭氏碘 液、95%乙醇、番紅液（沙皇復(fù)染液） 其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒 精燈、無菌生理鹽水、香柏油、二甲 苯等。,基本原理,革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。 1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。,實驗內(nèi)容,對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡 萄球菌分別進行革蘭氏染色。 對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌混合涂片進 行革蘭氏染色。,經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色 經(jīng)碘液媒染 用酒精脫色 有的細菌紫色不被脫去（G+）， 有的可被脫去（G

2、-）,步驟,脫色后再用一種紅色染料，如堿性番紅等進行復(fù)染。 陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。 有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌，以及所有的放線菌和真菌都成革蘭氏正反應(yīng)（G+） 弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都成負反應(yīng)（G-）,革蘭式陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。 革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度低，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。,與細菌細胞壁的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)有關(guān) 革蘭氏陽性細菌由于細胞壁肽聚糖含量高，脂類含量低，乙醇處理使細胞壁脫水，肽聚糖層孔徑變小，

3、通透性降低，結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細胞內(nèi)，細胞不被脫色。,革蘭氏陰性菌細胞壁脂類物質(zhì)含量高，肽聚糖含量較低，乙醇溶解了脂類物質(zhì)，使細胞壁通透性增加，結(jié)晶紫碘復(fù)合物易被抽出，于是被脫色。,陽性菌菌體等電點較陰性菌低，在相同pH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料較多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。,方法與步驟,涂片干燥固定草酸銨結(jié)晶紫染色（1min）水洗路哥氏碘液媒染（1min）水洗95%乙醇脫色（30s）水洗番紅復(fù)染（1min）水洗干燥鏡檢。,制 片,取一片載玻片，在中央滴一小滴生理鹽水，用接種環(huán)以無菌操作，從單個菌落中挑取少量的菌于生理鹽水滴中，混勻并涂成薄膜,干 燥

4、,涂面朝上，瞬間通過火焰2-3次，使生理鹽水完全干。,初 染,在菌膜上滴加結(jié)晶紫染色1分鐘，用蒸餾水進行沖洗（不要正對著菌膜沖，以免將細菌沖掉），至無紫色液體流出。,固 定,用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋菌膜1分鐘，對結(jié)晶紫染色進行鞏固，之后用蒸餾水對其進行沖洗，至無顏色流出為止。,脫 色,將玻片傾斜，用滴管吸95%的酒精進行沖洗脫色30秒，立即用蒸餾水沖洗。,復(fù) 染,用沙皇復(fù)染液對其進行復(fù)染1分鐘，用蒸餾水沖洗。,鏡 檢,用濾紙將水吸干，滴1滴香柏油在菌膜中央，用油鏡觀察。,嚴格掌握乙醇脫色程度，如脫色過度，則陽性菌被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌被誤染為陽性菌。 菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間很長，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng),關(guān)鍵點,大腸桿菌（G-）,枯草芽孢桿菌（G+）,金黃色葡萄球菌與大腸桿菌,實驗思考題,大腸桿菌和枯草芽孢桿菌染色后，是