1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),馮曉桃 廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,一、細(xì)胞培養(yǎng)概念,從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存、生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。,細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn),1、條件可控：研究影響因素 2、體外： 可用各種手段研究 3、長(zhǎng)期： 遺傳性狀 4、大量提供條件相同的細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)目的和作用,1、科學(xué)研究 藥物研究與開發(fā) 新藥篩選：如化學(xué)合成藥物藥效研究,中藥有效成分篩選與鑒定等。 疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā),細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究與開

2、發(fā)等。 細(xì)胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā),人參皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā)。 單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體,治療用單克隆抗體。,細(xì)胞培養(yǎng)目的和作用,基礎(chǔ)研究 (1) 藥物作用機(jī)理； (2) 基因功能； (3) 疾病發(fā)生機(jī)理。 2、生物制藥 疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程藥物生產(chǎn)：如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子如干擾素,粒細(xì)胞生長(zhǎng)因子,胸腺肽等。 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)。 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)：生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽,生物活性物質(zhì)等。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（一） 實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備 1. 無菌操

3、作實(shí)驗(yàn)室 無菌操作間、緩沖間、更衣室等。 2. 生物安全柜（超凈工作臺(tái)） 生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來保護(hù)操作者本人、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,生物安全柜分類 一級(jí)：可保護(hù)工作人員和環(huán)境而不保護(hù)樣品，目前已很少用。 二級(jí)：提供工作人員、環(huán)境和產(chǎn)品的保護(hù)。 A（A1和A2） B（B1和B2） 三級(jí)：生物安全3、4級(jí)實(shí)驗(yàn)室用。,生物安全柜,ESCO AC2-4S1,生物安全柜,三級(jí)生物安全柜,3.相關(guān)儀器設(shè)備 （1）CO2培養(yǎng)箱 （2）倒置顯微鏡、普通顯微鏡

4、及照相系統(tǒng) （3）冰箱（4度，-20度，-80度） （4）超純水系統(tǒng)（電阻率 18.2M.cm ） （5）細(xì)胞存儲(chǔ)器（液氮罐，深低溫冰箱、-80度冰箱） （6）高溫高壓滅菌裝置、清洗裝置 （7）濾菌相關(guān)儀器（針式濾器，泵加壓過濾） （8）離心機(jī)、天平、pH儀、移液槍等,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（二）培養(yǎng)用品 （1）培養(yǎng)瓶（25 、75 cm3） 培養(yǎng)板（96、48、24、12、6孔） 培養(yǎng)皿（各種直徑規(guī)格）,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（二）培養(yǎng)用品 （2）離心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）凍存管、EP管 （5）試劑瓶等。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （1）培養(yǎng)基

5、MEM，DMEM，RPMI1640 4保存，避免光照；用前放在37溫?zé)帷?二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （1）培養(yǎng)基 水 無機(jī)鹽 氨基酸 維生素 其他成分葡萄糖、酚紅、HEPES、丙酮酸鈉,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （1）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基選擇：按提供細(xì)胞來源的要求準(zhǔn)備。 什么情況下選擇無酚紅培養(yǎng)基： 酚紅影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞樣品,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （2）血清,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,血清分類 1、特級(jí)胎牛血清（最高級(jí)別的） （1）Hyclone 北美特級(jí)胎牛血清（SH30070.03） （2）Gibco北美特級(jí)胎牛血清（160

6、00-044） 2、優(yōu)等級(jí)胎牛血清（1）Hyclone加拿大優(yōu)等胎牛血清（SH30396） （2）Hyclone澳大利亞優(yōu)等胎牛血清（SH30084）（3）Gibco澳大利亞胎牛血清（10099-141）,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,血清分類 3、普通進(jìn)口胎牛血清 如Hyclone南美胎牛血清（SV30087） 4、國(guó)產(chǎn)的各種系列胎牛血清 國(guó)產(chǎn)的胎牛血清，國(guó)內(nèi)沒有嚴(yán)格意義的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而國(guó)內(nèi)都是剖腹產(chǎn)出胎牛，8小時(shí)左右取血，然后，進(jìn)行過濾分裝。 5、其他血清 新生牛血清，小牛血清，一般國(guó)產(chǎn)的。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （2）血清 使用：5 20%。 保

7、存：20-70儲(chǔ)存； 4存放勿超過一個(gè)月。 解凍步驟： -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝或使用。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀物出現(xiàn)，該如何處理? 原因：脂蛋白的變性； 血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，也是造成絮狀物的主要原因之一。這些絮狀物的產(chǎn)生不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。 去除方法：可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g 稍微離心，將上清液加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您直接過濾血清以去除這些絮狀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過濾膜。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 血清熱滅活： 56, 30 分鐘加熱

8、已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。目的：使血清中補(bǔ)體成份失活。 啟動(dòng)的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，啟動(dòng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。在免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 除非必須，一般不建議作此熱處理。,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（二）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （3）緩沖液 Hanks、PBS 4保存，避免光照；用前放在37溫?zé)帷?二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（4）抗生素 工作濃度 儲(chǔ)存溫度 殺滅細(xì)菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G

9、(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（5）添加因子 生長(zhǎng)因子（ EGF、FGF、BFGF）、胰島素、肝

10、素、二巰基乙醇等 （6）消化液 胰酶（0.25%、0.125%）、EDTA（0.02%） 消化效果與濃度、溫度、時(shí)間、pH值等相關(guān),二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（三）細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 （7）其他 谷氨酰胺： 終濃度2 mmol/L HEPES： 10-25 mmol/L 丙酮酸鈉： 終濃度1 mmol/L 2-巰基乙醇：終濃度50 uM 1.細(xì)胞培養(yǎng)介紹.flv,二、培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)條件,（一）基本操作 1. 無菌操作 防止微生物污染； 培養(yǎng)用一切物品、液體都無菌。 （37度預(yù)熱，或室溫平衡） 2. 操作區(qū)消毒 75%酒精擦拭（生物安全柜，進(jìn)入操作區(qū)物品） 紫外消毒20-30 min 3.洗手和著裝 4.

11、 實(shí)驗(yàn)操作 動(dòng)作穩(wěn)、準(zhǔn)，幅度??； 物品擺放合理，工作有序，縮短暴露時(shí)間。 2.滅菌消毒.flv,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（二）細(xì)胞來源 1. 原代培養(yǎng) 從機(jī)體上取下細(xì)胞、組織或器官，讓它們?cè)隗w外維持與生長(zhǎng)。（實(shí)際中，傳10代以內(nèi)的細(xì)胞用作原代培養(yǎng)細(xì)胞） 特點(diǎn)：表現(xiàn)來源組織或細(xì)胞特征。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（二）細(xì)胞來源 （1） 組織塊培養(yǎng)法 從機(jī)體上取下組織，使其在體外維持與生長(zhǎng)，細(xì)胞從組織塊邊緣向外長(zhǎng)出，鋪滿培養(yǎng)瓶（皿），即可進(jìn)行傳代。 特點(diǎn)：表現(xiàn)來源組織或細(xì)胞特征。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（二）細(xì)胞來源 （1） 組織塊培養(yǎng)法 基本過程： 無菌條件下，取組織，去掉組織表面血污 剪成小塊（0.5 1 mm

12、3） 反復(fù)漂洗 （Hanks液和完全培養(yǎng)液） 接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱培養(yǎng) 長(zhǎng)滿后傳代,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（二）細(xì)胞來源 （2） 消化培養(yǎng)法 與組織塊培養(yǎng)法區(qū)別： A. 用酶制劑處理組織塊，除去細(xì)胞間質(zhì)，使細(xì)胞分離，形成細(xì)胞懸液； B. 細(xì)胞生長(zhǎng)方式多為單層。 優(yōu)點(diǎn)：更易攝取營(yíng)養(yǎng)、排除代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)較快。 缺點(diǎn)：操作繁雜，易污染；消化可能對(duì)細(xì)胞有損傷。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（二）細(xì)胞來源 2. 細(xì)胞系（cell line） 原代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系

13、或無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿,原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期,（二）細(xì)胞來源 3.細(xì)胞株（cell strain） 從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（substrain）。 細(xì)胞庫： 美國(guó)菌種保藏中心（ATCC） / 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 上海細(xì)胞庫 各科研機(jī)構(gòu),三、

14、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),培養(yǎng)細(xì)胞的特性,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式 貼附生長(zhǎng)： 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。大多數(shù)細(xì)胞屬此型。失去在體內(nèi)特有形態(tài)。 成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走型、多形型。 懸浮生長(zhǎng)： 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。,每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程,游離期 貼壁期 潛伏期 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 停止期（平臺(tái)期）,游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 10分鐘一4小時(shí),貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘

15、素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。 進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）,潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期： 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。,停止期（平臺(tái)期）： 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性,（三）細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)操作技術(shù) 1. 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法

16、。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),貼壁細(xì)胞傳代操作流程： （1）棄去培養(yǎng)液。 （2）加入胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。 （3）消化時(shí)間約為1 3分鐘。倒置鏡下觀察細(xì)胞。原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，細(xì)胞間出現(xiàn)空隙，細(xì)胞未漂起時(shí)棄去胰酶，同時(shí)用Hanks或培養(yǎng)液終止消化。 （4）制作細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)（有經(jīng)驗(yàn)者可?。?，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)，按1:2 1:6進(jìn)行傳代，置37下繼續(xù)培養(yǎng)。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),附：消化液配制方法： 稱取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無Ca 2+ 、Mg

17、 2+ 的Hanks液（D-Hanks ）溶解，濾器過濾除菌，4保存，用前可在37下回溫。 可配成1%溶液， -20保存，用前稀釋成0.25%。 胰酶溶液中也可加入EDTA，使最終濃度達(dá)0.02。 3.細(xì)胞傳代.flv,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),2. 細(xì)胞凍存 在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在130以下的低溫中能減少冰晶的形成。 目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)

18、胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),細(xì)胞凍存操作 （1）收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞定量。 （2）加入保護(hù)液（10%DMSO），調(diào)整至410106/ml左右。 （3）將懸液分至凍存管中，每管1 ml。 （4）將凍存管口封嚴(yán)。 （5）貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等。 （6）標(biāo)準(zhǔn)降溫速度： -1-2 /min； 溫度達(dá)到-25 時(shí)，-5-10 /min； 到-70 時(shí)，直接放入液氮。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),細(xì)胞凍存操作 一般降溫順序：室溫4（20分鐘低溫冰箱（20 30 min）超低溫冰箱（80 ）或直接放入液氮。 注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液

19、氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，絕對(duì)不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用11.5月。 細(xì)胞凍存量很大時(shí)：可用細(xì)胞凍存儀。置80 冰箱過夜后，直接放入液氮保存。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),凍存液配制： 培養(yǎng)基加入甘油或DMSO，使其終濃度達(dá)520%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4下保存。 4.細(xì)胞凍存.flv,3. 細(xì)胞復(fù)蘇 細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的50，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),3. 細(xì)胞復(fù)蘇 操作： （1）從液氮中取出凍存管、迅速置于37 溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。 （2）打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中，加10ml培養(yǎng)液

20、或Hanks液，1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。 （3）細(xì)胞沉淀加10ml培養(yǎng)液或Hanks液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。 （4）加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況。 解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。 細(xì)胞復(fù)蘇 高清.kux,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定 培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)

21、胞是否有損傷作用。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（1） 細(xì)胞計(jì)數(shù) A. 將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 B. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 C. 靜置3分鐘。 D. 鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4104,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（1） 細(xì)胞計(jì)數(shù) 注意： 細(xì)胞要分散成單個(gè)細(xì)胞； 鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液； 對(duì)于壓線的細(xì)胞：只計(jì)算上線和左線。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（1） 細(xì)胞計(jì)

22、數(shù) 另外：可以用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（2） 細(xì)胞活力測(cè)定 A. MTT法 B. XTT法 C. CCK-8法,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),5. 細(xì)胞增殖檢測(cè) （1）MTT：化學(xué)名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。 缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚

23、產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（2）XTT法 XTT：化學(xué)名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲瓚產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。 優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測(cè)快速；3、靈敏度高，甚至可

24、以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。 缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（3）CCK-8法或稱WST-8法 CCK-8試劑中含有WST8：化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗

25、腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（3）CCK-8法或稱WST-8法 優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、檢測(cè)快速；3、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對(duì)細(xì)胞毒性??；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。 缺點(diǎn)：1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),操作步驟： a. 96孔板細(xì)胞經(jīng)過干預(yù)處理 b. MTT法：去掉培養(yǎng)液，加入80ul培養(yǎng)液+20ulMTT（0.5%） XT

26、T法：直接加入XTT 50ul （0.1%XTT+1.5%硫酸甲醋吩嗦 PMS：1ml：30ul） CCK-8：直接加入CCK-8 10ul c. MTT法：培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150ul溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測(cè)。 XTT法：培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)。 CCK-8：培養(yǎng)1-4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),（4）BrdU法 （5）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng),三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),6. 細(xì)胞周期分析,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),6. 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。 G1期（first gap）從有絲分

27、裂完成到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點(diǎn)是物質(zhì)代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),6. 細(xì)胞周期分析 G1期（first gap）細(xì)胞進(jìn)入G1期后，并不是毫無例外地都進(jìn)入下一期繼續(xù)增殖，在此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)三種不同前景的細(xì)胞：增殖細(xì)胞：這種細(xì)胞能及時(shí)從G1期進(jìn)入S期，并保持旺盛的分裂能力。暫不增殖細(xì)胞或休止細(xì)胞（G0期）：這類細(xì)胞進(jìn)入G1期后不立即轉(zhuǎn)入S期，在需要時(shí)，如損傷、手術(shù)等，才進(jìn)入S期繼續(xù)增殖。不增殖細(xì)胞：此種細(xì)胞進(jìn)入G1期后，失去分裂能力，終身處

28、于G1期，最后通過分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞及成熟的紅細(xì)胞等。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),6. 細(xì)胞周期分析 S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時(shí)還要合成組蛋白。 G2期（second gap）期為DNA合成后期，是有絲分裂的準(zhǔn)備期。在這一時(shí)期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質(zhì)，包括微管蛋白和促成熟因子等。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),分析方法： （1）顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)分析； （2）BrdU法； （3）流式細(xì)胞術(shù)：明確各期細(xì)胞數(shù)及百分比。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),7. 細(xì)胞凋亡分析 細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因基控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。 形

29、態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個(gè)細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),7. 細(xì)胞凋亡分析 （1） 電鏡檢查：在電鏡下可見細(xì)胞膜表面凸出形成典型的凋亡小體，內(nèi)含有

30、正常形態(tài)的線粒體和其他細(xì)胞器。細(xì)胞質(zhì)高度濃縮。核染色質(zhì)濃縮成月牙狀，同時(shí)形成一些核仁碎片，核膜凹陷使胞核裂開。 （2）DNA檢測(cè)：凋亡細(xì)胞的基因組DNA核小體之間連接的雙鏈DNA被切斷，從而產(chǎn)生180-200bp的多倍體DNA片段。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)一典型的DNA梯形(DNA ladder)，與壞死細(xì)胞出現(xiàn)的DNA隨機(jī)降解帶型有明顯的區(qū)別。,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),7. 細(xì)胞凋亡分析 （3）TdT介導(dǎo)的dUTP缺口標(biāo)記分析法：細(xì)胞在凋亡時(shí)，其基因組DNA在核小體之間被切斷，產(chǎn)生許多3-OH末端。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將地高辛標(biāo)記的dUTP摻入到DNA片段的3-OH末端，然后再加入經(jīng)熒光標(biāo)記的抗地高辛抗體，使其與地高辛特異結(jié)合，在熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色熒光。 （4）應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析,三、培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù),8. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的問題 （1）培養(yǎng)液pH值快速偏離 ：CO2濃度異常，培養(yǎng)瓶蓋過緊 ；細(xì)菌、酵母或霉菌污染