1、,第七章 酶聯(lián)免疫分析法,第七章 酶聯(lián)免疫分析法,基本要求： 了解免疫分析發(fā)展史，掌握抗原、抗體和免疫反應的原理，了解免疫分析法的分類，熟悉酶標記免疫分析法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相載體、包被與封閉、稀釋液、洗滌液、酶反應終止液及ELISA法常用酶的底物系統(tǒng)，掌握ELISA的酶聯(lián)方法和試驗方法，熟悉ELISA反應條件的選擇，掌握ELISA的定量計算，了解ELISA的靈敏度提高途徑，熟悉ELISA放大系統(tǒng)。了解化學發(fā)光分析的原理，熟悉化學發(fā)光劑的種類，熟悉化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的標記酶和發(fā)光增強劑，熟悉生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的生物發(fā)光反應體系。,第七章 酶聯(lián)免疫分

2、析法,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 第二節(jié) 光度酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,一、免疫分析 1、免疫分析發(fā)展史 免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待測物質(zhì)（抗原或抗體）與其相對應物質(zhì)（抗體或抗原）之間專一特異性反應而建立起來的一種高選擇性分析方法。 免疫分析主要基于用抗體（或抗原）作為選擇性化學試劑以分析測定抗原（或抗體）及半抗原。 宋代 人工痘苗預防烈性傳染病天花 1971年 第一屆國際免疫學會議 將免疫學與微生物學分開發(fā)展成一門獨立的學科。,“免疫（immunity）”一詞源于 “immunitas”，原意是免除稅賦和差役。 研究早期免疫學多集中

3、在抗體抗感染能力研究。 20世紀中期以后，人們逐漸開始對各種抗原、微生物的作用進行研究，發(fā)展出基礎(chǔ)免疫學、臨床免疫學、免疫學檢測、醫(yī)學免疫學等多個分支。 現(xiàn)代免疫學將“免疫”定義為：機體對“自己”和“異己”識別、應答過程中所產(chǎn)生的生物學效應的總和，正常情況下是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生理性功能。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,2、抗原、抗體與免疫反應 抗原是能夠引起免疫反應的分子。 免疫原性（immunogenicity）指誘導刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞的能力。 具有免疫原性的物質(zhì)稱為免疫原（immunogen）。 免疫反應原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenici

4、ty），指能與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合，引起免疫反應的性能。 具備上述兩種特性的物質(zhì)為完全抗原，僅具有免疫反應性的物質(zhì)被稱為半抗原（hapten）。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,抗體是能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。 所有的抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗體。 例如無免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不是抗體，盡管其結(jié)構(gòu)與抗體相似。 抗體主要存在于血清內(nèi)，但在其他體液及外分泌液中也有存在。 抗原抗體分子之間存在著結(jié)構(gòu)互補性和親和性，使得抗原與相應抗體之間極易發(fā)生結(jié)合反應，這種反應具有高特異性（即專一性）和可逆性。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,抗原、抗體發(fā)生如下免

5、疫反應： Ag+Ab Ag-Ab 該免疫反應遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學基本原理，其反應式為 式中：Ab為游離的抗體結(jié)合位點的濃度；Ag為游離的抗原結(jié)合位點的濃度；Ab-Ag為抗原-抗體復合物的濃度；k1為正反應速率常數(shù)；k2為負反應速率常數(shù)；K為反應平衡常數(shù)（親和常數(shù)）。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,這種抗原-抗體反應既可發(fā)生于體內(nèi)（in vivo），也可發(fā)生于體外（in vitro）。 抗體主要存在于血清中，在抗原、抗體的檢測中多采用血清做試驗，所以體外抗原-抗體反應也稱為血清學反應（serologic reaction）。 基于抗原-抗體反應的檢測技術(shù)主要應用于以下幾個方面：用已知

6、抗原檢測未知抗體； 用已知抗體檢測未知抗原； 定性或定量檢測體內(nèi)各種大分子物質(zhì)； 用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質(zhì)。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,二、酶標記免疫分析法及常用標記酶 1、免疫分析法分類,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,2、酶標記免疫分析法中使用的酶 （1）酶聯(lián)免疫分析中使用的酶應符合下列條件： 純度高、催化反應的轉(zhuǎn)化速率高、專一性強； 具有足夠的偶聯(lián)用標記基團，與抗原、抗體蛋白分子偶聯(lián)后仍保持較高的催化活性； 使用穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性好； 測定酶活性的方法簡便、靈敏、快速； 待測體液中不存在與標記酶相同的酶；,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,待測溶液中應該無底物、反應抑制劑和其他與酶

7、發(fā)生反應的干擾物質(zhì)； 酶的來源、純化和供應較方便，價格較低廉； 均相酶免疫測定法中使用的酶，還要求當抗體與半抗原-酶結(jié)合物結(jié)合后，酶活性表現(xiàn)出抑制或激活。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,（2）酶的評價指標 通常用RZ和酶的比活力評價標記酶的質(zhì)量。 RZ表示酶蛋白中活性部分與非活性部分最大吸光度的比值。 酶的比活力指在特定條件下，每1mg酶或每1ml酶液所具有的酶活性單位數(shù)。 （3）酶聯(lián)免疫分析中的常用酶 下表列出了酶聯(lián)免疫分析中的常用酶。其中EC編號是根據(jù)國際酶學委員會的規(guī)定采用四碼編號法確定的每個酶的系統(tǒng)編號。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,酶聯(lián)免疫分析常用酶,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,辣根過氧化物

8、酶（horseradish peroxidase，HRP）是一種提取自辣根中，相對分子質(zhì)量為44kDa的糖蛋白。 其酶學活性部分包括脫輔基蛋白和血紅素基團，輔基亞鐵血紅素在403nm波長呈現(xiàn)最大光吸收值。 HRP的純度以RZ值即A403nm/A275nm的值來衡量，高純度HRP制劑的RZ3.0。 通常以能在20、pH為6.0、20s的時間內(nèi)催化底物鄰苯三酚產(chǎn)生1mg紅桔酚（purpurogallin）作為HRP酶的1個活性單位。 用于標記的HRP比活性應大于250U/mg。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）幾乎存在于動物和人體的所有組織中，

9、尤其在肝臟、胎盤、白細胞、腎小管中含量高。 AP是一種磷酸酯的水解酶，它能夠催化磷酸單酯、磷酸核苷及6-磷酸糖類等的水解，在釋放磷酸鹽的同時產(chǎn)生有色的或熒光的產(chǎn)物。 堿性磷酸酶的分子質(zhì)量為80100kDa，最適pH為8.010.0，隨酶源和底物的不同而變化。 AP活性的測定以對硝基磷酸苯酯（PNP）作為底物。 用作標記的AP比活力應大于1000U/mg。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）即-D-葡萄糖氧化還原酶，一般由黑曲霉和青霉產(chǎn)生。 它催化O2和-D-葡萄糖的反應形成H2O2和D-葡萄糖酸-內(nèi)酯，酯再與水反應生成葡糖酸。 其反應最適pH范圍為

10、4.07.0，pH5.5時，反應速率最大。葡萄糖氧化酶對-D-葡萄糖的-異頭碳有高度專一性。 葡萄糖氧化酶的比活力至少為20U/mg。 葡萄糖氧化酶在4下可穩(wěn)定存在612個月。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,-D-半乳糖苷酶（-D-galactosidase，Gal）即乳糖酶（-lactase），廣泛存在于植物、動物器官、細菌、酵母和真菌中。 當Gal催化水解-D-半乳糖苷時，若得到的半乳糖殘基轉(zhuǎn)移到水分子受體，稱為水解；若受體是糖或醇時，稱為轉(zhuǎn)半乳糖苷。 Gal催化-D-半乳糖苷水解反應的最適pH為7.5，轉(zhuǎn)化效率很高，且比HRP易于標記，背景值低，穩(wěn)定性好。 Gal比活力應不少于30U/mg，

11、5能保存12年。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,一、光度酶聯(lián)免疫分析 1、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面； 抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標抗原或抗體； 在測定時，使受檢標本和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相抗原或固相抗體起反應； 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例； 加入酶反應底物，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標本中受檢物的量相關(guān)，用分光光度法進行定量。,*Ag是酶標志抗原，Ag是未

12、標志抗原，Ab是特異性抗體，(F)表示游離型的*Ag，(B)表示結(jié)合型的*Ag-Ab。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,2、ELISA的固相載體 良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。 最常用的是聚苯乙烯。 聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 ELISA載體的形式有小試管、小珠和微量反應板。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,3、固相載體的包被與封閉 （1）包被（coating）指將抗原或抗體連接到固相載體上的過程。 以聚苯乙烯微量反應板為例，通常先將抗原或抗體溶于pH 9.6的碳酸鹽緩沖液（或pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，pH

13、 78的Tris-HCl緩沖液）中，加滿反應孔，置4過夜，洗滌即可。 包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 一般蛋白質(zhì)的包被濃度為0.120g/ml。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）封閉（blocking）指繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。 封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 所有的ELISA固相載體均需封閉。 常用封閉劑有0.05%0.5% BSA；10%小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可高濃度使用（5%）。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,4、稀釋液、洗滌液和酶

14、反應終止液 （1）稀釋液用于稀釋酶標抗體及標本。 常用中性PBS或Tris-HCl緩沖液，其中含有無關(guān)高濃度蛋白（如10動物血清、1BSA（牛血清白蛋白）、1明膠等）和非離子型表面活性劑（如0.05Tween 20或TritonX-100等）。 （2）洗滌液一般與稀釋液相同，常用PBS或Tris-HCl緩沖液。 四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表7-2。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（3）酶反應終止液 辣根過氧化物酶（HRP）反應終止液為2mol/L4mol/L H2SO4（HRP在酸性條件下喪失酶活性）。 很多ELIS

15、A試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶，用3mol/L NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,5、ELISA法常用酶的底物系統(tǒng) ELISA法對底物的要求： 價廉易得、安全； 顯色性和穩(wěn)定性好； 底物本身最好為無色物質(zhì)； 終止酶催化反應后，底物不應再繼續(xù)地自發(fā)性變性； 其最終產(chǎn)物可溶、易于測定及光吸收值高。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（1）辣根過氧化物酶的底物系統(tǒng) 常見底物有鄰苯二胺（OPD，產(chǎn)物橙紅色，測定波長492nm）、5-氨基水楊酸（5-AS，產(chǎn)物橙色，測定波長550nm）、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，產(chǎn)物紅色，測定波長450nm）、2,2-

16、連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）等。 ABTS的反應曲線不好。 OPD溶液具有光敏性，相對來說不穩(wěn)定，且具有誘變特性。 TMB的背景值低，溶液穩(wěn)定，沒有誘變特性。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）堿性磷酸酶的底物系統(tǒng) 常用的底物為對硝基磷酸苯酯（PNP），水解的產(chǎn)物為黃色的對硝基苯酚，可在405nm處檢測其吸光度的變化，該底物的轉(zhuǎn)化效率高，線性關(guān)系好。 用酚酞磷酸酯為底物，水解生成的酚酞在堿性條件下呈紅色，可在530nm處光度法測定。 此外還可以百里酚酞單磷酸酯等為底物。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（3）-D-半乳糖苷酶的底物系統(tǒng) 常見底物有鄰硝基苯-D-半乳糖苷（O

17、NPG），其水解的產(chǎn)物鄰硝基苯酚在405nm處具有最大吸光度值。 其他的底物有對硝基苯-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-D-半乳糖苷、氯酚紅-D-半乳糖苷（CPRG）、9-羥基-3-異吩噁唑酮-D-半乳糖苷（RG）等。 （4）青霉素酶（PNC）的底物系統(tǒng) 常用底物有溴麝香草酚藍（BTB）、青霉酮酸還原淀粉-碘復合物（SIC）、溴甲酚紫（BCP）和溴麝香草酚藍（21）等。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,二、ELISA酶聯(lián)方法和試驗方法 1、ELISA酶聯(lián)方法 ELISA酶聯(lián)方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法 戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì)

18、。 戊二醛交聯(lián)法有一步法、兩步法兩種。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-2 戊二醛一步法反應原理,一步法 將戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。 該法操作簡便、有效，重復性好。 缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯(lián)。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-3 戊二醛二步法反應原理,兩步法 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體；或先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。 兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，有助于本底的改善。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）過碘酸鹽氧化法 本法只適用于含糖量較高的酶。 辣根過氧化物