1、生物電子顯微技術(shù),電子顯微鏡的基本知識 電子顯微鏡的類型及技術(shù)特征 透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 分析電子顯微鏡 雙束電子顯微鏡 掃描探針顯微鏡 電鏡生物樣品制作技術(shù) 超薄切片制作技術(shù) 負染色技術(shù) 掃描電子顯微鏡樣品制備技術(shù) 冷凍制樣技術(shù),第一章 電子顯微鏡的基本知識,11.電子顯微鏡的發(fā)展概況 12.電子顯微鏡的基本知識,11.電子顯微鏡的發(fā)展概況,一、電子顯微鏡的發(fā)明與發(fā)展：,科學(xué)理論的發(fā)展： 1924年物理學(xué)家（德布羅伊）證實了： 電子與光子一樣，具有波動性； 1926年物理學(xué)家布施發(fā)表了研究成果： “關(guān)于帶電粒子在軸對稱電場、磁場中具有聚焦作用”,1.電子顯微鏡發(fā)明的必然性與可能性,

2、裸眼觀察物體：,生物體的機體、器官、組織,光學(xué)顯微鏡觀察：,器官、組織、細胞,探索更微小的生命形式：病毒,人類的夢想與科學(xué)理論的支撐 促成了電子顯微鏡設(shè)計思想的產(chǎn)生！,2.電子顯微鏡的誕生：,電子顯微鏡于1931年，在德國柏林大學(xué)高壓實驗室由 Knoll 和RUska研制成功，證實了由電子束為光源、電 子透鏡組成的電子光學(xué)系統(tǒng)，可以對物體放大成像。 1932年宣告電子顯微鏡誕生。分辨率50納米 。,1939年,Ruska在西門子公司研制生產(chǎn)了世界上第一系列 商品透射電鏡，分辨率僅10nm，40臺； 20世紀40年代，美國的希爾用消像散器補償電子透鏡的旋轉(zhuǎn) 不對稱性，使電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)有了新

3、的突破，逐步達 到了現(xiàn)代水平。 1935年，Knoll首先提出了掃描電鏡的設(shè)計思想和工作原理； 1942年，M.Mullan在劍橋大學(xué)研制成功世界上第一臺 掃描電鏡實驗室裝置； 1965年由劍橋大學(xué)儀器公司生產(chǎn)出世界上第一批 商品掃描電鏡，分辨率50100nm，放大倍數(shù)僅1萬倍。,初級階段的電鏡：功能單一，電子管元件，體積龐大，操作復(fù)雜。,3.電子顯微鏡發(fā)展的成熟階段,20世紀6080年代， 電子顯微鏡的理論研究 及生產(chǎn)技術(shù)達到成熟的時期。,分辨率達到6.0nm;放大率達到30萬倍。,分辨率達到0.2nm;放大率達到80萬倍。,特點：晶體管時代，功能多樣化，操作較復(fù)雜！,4.現(xiàn)代電子顯微鏡,高

4、性能、多功能、結(jié)構(gòu)緊湊、微機化控制/操作,操作系統(tǒng)微機化,二、我國電鏡事業(yè)的發(fā)展概況,1.我國電鏡的研制概況：,2.我省電鏡應(yīng)用概況：太原理工大學(xué)，山西醫(yī)科大學(xué),三、電子顯微應(yīng)用技術(shù)的概況：,始于20世紀50年代； 1959年中科院精密儀器研究所研制成功第一臺透射電鏡XD-100型； 1965年中科院科儀廠研制成功DX-3型透射電鏡，分辨率達到0.3nm； 1977年上海新躍儀表廠研制出DXB-12型透射電鏡，分辨率達到0.2nm; 中科院科儀廠自KYKY-1000B以后，KYKY-2800型，KYKY-3800型掃描電鏡。,常規(guī)超薄切片技術(shù) 常規(guī)掃描制樣技術(shù) 冷凍復(fù)型技術(shù) 細胞化學(xué)技術(shù)：酶的

5、細胞化學(xué) 免疫電鏡技術(shù) 負染色技術(shù)：快速診斷 現(xiàn)代電鏡將超微結(jié)構(gòu)觀察與加工一體化,一、電子顯微鏡的計量單位：,動、植物器官,1m=10-6m 1nm=10=10-9m,1mm=10-3m,1mm=10-3m 1m=10-6m,12.電子顯微鏡的基本知識,二、電子顯微鏡的照明源電子束,1.電子槍的結(jié)構(gòu)：,3V3A,陰極：鎢燈絲，產(chǎn)生電子,柵極：控制電子束,陽極：加速電子運動,2.電子束的產(chǎn)生,加燈絲電壓使燈絲加熱， 尖端溫度升高 到2227時逸出電子， 當溫度升高到2480時逸出大量電子， 這些自由電子在高壓作用下， 形成高能電子束。,三、電子透鏡系統(tǒng),1.理論依據(jù)：1926年，德國物理學(xué)家布施

6、發(fā)現(xiàn)：一切帶 電粒子在旋轉(zhuǎn)軸對稱磁場或電場中，運動軌跡可以被 折射而會聚。電子束聚焦的關(guān)鍵理論。,2.電子透鏡的類型,四、電子透鏡的像差：,像差的主要類型,電子光學(xué)系統(tǒng)與理想光學(xué)系統(tǒng)成像的差別，稱為像差。,1.球差：透鏡缺陷使近軸磁場與邊緣磁場對電子束偏轉(zhuǎn)能力不同，使一質(zhì)點成像為一個彌散球。,2.像散：由材料性質(zhì)和加工精度不良引起的磁場分布呈 非對稱性，造成在X,Y方向的放大率不同使圖像變形。,3.色差：電源波動引起加速電壓波動，造成電子束波長 的變化，使圖象分辨率下降。,4.畸變：磁場軸上聚焦能力 弱于軸外聚集能力而使圖 象變形。,五、分辨率,2.影響分辨率的因素：,鏡筒組件加工精度、組裝調(diào)

7、試水平、材料性質(zhì) 電鏡工作狀態(tài)：加速電壓、合軸狀態(tài)、真空及電源穩(wěn)定性 樣品因素：樣品性質(zhì)、厚度、本身細節(jié)、導(dǎo)電性等。,3.實際分辨率,當加速電壓為100時，=0.37nm， 要求0=1.1x10-2rad,則：=2.05=0.2nm,顯微鏡能夠分辨出兩質(zhì)點之間最小距離的能力。,1.理想分辨率：,電子束波長約：0.005nm 那么：理想=0.0025nm,前提條件： 儀器性能最佳 樣品最佳 操作最佳,六、放大率（放大倍數(shù)）,1.放大倍數(shù)：指線性放大，即在顯微鏡下觀察到的物體 長度與其實際長度的比值。,2.有效放大倍數(shù)：指裸眼分辨率與顯微鏡分辨率的比值。,即：M有效=眼/儀,已知：人=0.2mm

8、當=0.2nm時，M有效=0.2mm/0.2nm=100萬倍 當=0.5nm時 M有效=0.2mm/0.5nm=40萬倍 當=1.0nm時 M有效=0.2mm/1.0nm=20萬倍 當=5nm時， M有效=0.2mm/5nm=4萬倍 !,超出此范圍的放大稱為空放大。是毫無價值的放大。,裸眼分辨率：0.2mm 光鏡分辨率：=0.62/n*sin=200nm=0.2m 電鏡分辨率：0.2nm,七、電子束與樣品的相互作用關(guān)系,掃描電鏡,掃描透射,透射電鏡,透射電鏡信號主要由透射電子、部分散射電子形成。 掃描電鏡信號主要由二次電子形成。,能量分析,電子顯微鏡中的電子信號,2.透射電子:當樣品足夠薄(小

9、于50納米)時,部分入射電子可以 穿透樣品而到達熒光屏成像,這些電子叫做透射電子. 3.彈性散射電子:入射電子與樣品物質(zhì)原子或核外電子碰撞后， 使運動軌跡發(fā)生改變.這些電子叫做彈性散射電子. 4.非彈性散射電子:入射電子通過樣品時,雖未發(fā)生碰撞,但受到 樣品物質(zhì)庫侖場的作用,有部分能量損失而使運動速度 變慢,運動方向不變.這部分電子叫做非彈性散射電子.,1.入射電子:由電子槍產(chǎn)生的高能電子,又叫一次電子.,透射電子與彈性散射電子和非彈性散射電子比例 是形成電子圖象反差的主要因素.,5.二次電子:入射電子進入樣品,使得樣品物質(zhì)原子的核外電子 受入射電子激發(fā),獲得一定能量而逸出樣品表面,這些電子被

10、 稱為 二次電子. 只有在樣品10nm表層產(chǎn)生的二次電子可以逸出樣品表面. 所以,二次電子能夠反映樣品表面的形態(tài)結(jié)構(gòu).,6.背散射電子:在樣品表層501000nm深度,入射電子與樣品 物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞后,被反射出來的電子,叫做背散射電子. 背散射電子產(chǎn)生的數(shù)量與入射電子的能量,樣品成分等有關(guān), 這一信號可以反映出樣品表面形態(tài)和成分的差異的圖像.,7.陰極X射線:樣品原子被入射電子電離后,可以發(fā)出特征X射線. X射線的強度與激發(fā)區(qū)域內(nèi)對應(yīng)的元素含量有關(guān). 所以,通過檢測特征X射線的強度,可以得出該區(qū)域內(nèi)的元素分布.,八、場深、焦深：,1.場深：指軸上物方的一 段距離。在這一范圍內(nèi) 移動樣品到任何位置， 都能聚焦清晰。,D0=/0,當電壓為100KV， 0=5x10時，要求=1nm，D0=200nm; 若 要求=0.