1、國外植物藥的研究與開發(fā),第四章 國外植物藥生產(chǎn)中現(xiàn)代科技成果的應(yīng)用,中藥學(xué)院 天然藥物化學(xué)教研室,陳麗霞,1、植物原料的種植、采摘 2、現(xiàn)代化的制藥技術(shù)設(shè)備 3、生產(chǎn)過程中的標(biāo)準(zhǔn)化控制,1、植物原料的種植、采摘,歐洲藥典、英國藥典、美國藥典國家處方集和日本藥局方均重視對植物藥中的農(nóng)藥殘留和重金屬限量檢查，美國藥典國家處方集還對植物藥的微生物檢查具有明確規(guī)定。 近年來，中國出口的中藥材、中成藥因鎘、鉛、砷、汞等重金屬和農(nóng)藥殘留量超標(biāo)而受阻，使中醫(yī)藥的聲譽(yù)受到一定影響。 如何完善中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促使中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌，走向國際化，是當(dāng)前中藥國際化面臨的迫切問題。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的國際化將有助于中藥的

2、國際化。,1.1 國外對植物藥原料的標(biāo)準(zhǔn),不同國家和地區(qū)使用植物藥的程度不同，對其質(zhì)量控制的理念也不一致，所制定標(biāo)準(zhǔn)的條目和規(guī)定的檢測限量也各不相同。 不同國家和地區(qū)對食品補(bǔ)充劑或植物藥中的重金屬和農(nóng)藥殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)有較大區(qū)別。,如：在重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)方面，香港、中國內(nèi)地、韓國、英國以及世界衛(wèi)生組織均對鉻（Cr）沒有設(shè)定限量要求，而美國則對鉻（Cr）設(shè)立限量標(biāo)準(zhǔn)。,1.2 植物原料的種植采摘,天然藥物涉及到藥材資源問題：人工栽培有利于藥材標(biāo)準(zhǔn)化。 對藥材進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的種植管理，可以提高藥材的產(chǎn)率。 選擇污染較小的栽培基地,減少污染。 選擇地道藥材進(jìn)行栽培,保證藥材的質(zhì)量。 科學(xué)確定植物的生長時(shí)間，

3、植物生長時(shí)間不同，有效成分的含量也不同。,1.2.1 銀杏的標(biāo)準(zhǔn)化栽培,銀杏最早出現(xiàn)于3.45億年前的石炭紀(jì)。中生代侏羅紀(jì)銀杏曾廣泛分布于北半球，白堊紀(jì)晚期開始衰退。 50萬年前，發(fā)生了第四紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)，銀杏在歐洲、北美和亞洲絕大部分地區(qū)滅絕，只有中國自然條件優(yōu)越，才奇跡般的保存下來。所以，被科學(xué)家稱為“活化石”，“植物界的熊貓”。 銀杏大都屬于人工栽培, 在中國、日本、朝鮮、韓國、加拿大、新西蘭、澳大利亞、美國、法國、俄羅斯等國家和地區(qū)均有大量分布。毫無疑問，國外的銀杏都是直接或間接從中國傳入的。,銀杏種植標(biāo)準(zhǔn)化：,銀杏的種植方法、苗木的管理、常見病蟲害防治都有標(biāo)準(zhǔn)化的管理，以保證原材料的質(zhì)量

4、。 例如，銀杏樹主干樹樁4-5年鋸伐一次，鋸伐后從根部分生出幼樹，生長、采摘4-5年，又再次鉅伐（研究證明，4-5年生樹葉有效成分含量最高）。,1.2.2 銀杏的質(zhì)量控制 由于銀杏的產(chǎn)地、種植技術(shù)和采收期不同對銀杏葉所含成分（內(nèi)酯和黃酮）也會(huì)有較大影響。德國的制藥企業(yè)在投產(chǎn)前首先要對銀杏葉的成分進(jìn)行分析，以保證原料的內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定。 銀杏葉有效成分基本上都采用HPLC 測定, 采用山奈素、槲皮素和異鼠李素作為對照品測定銀杏總黃酮的含量; 采用銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯A 為對照品測定銀杏內(nèi)酯的含量。具體測定方法分述如下：,1.2.2 銀杏的質(zhì)量控制 1.2.2.1 銀杏中黃酮苷含量的測定方法

5、 銀杏葉中總黃酮測定方法是: 銀杏葉黃酮主要成分是黃酮苷形式存在, 經(jīng)酸水解后生成黃酮醇類化合物, 主要是槲皮素、異鼠李素和山奈素三種組分。用HPLC 分離測定其含量, 再經(jīng)公式轉(zhuǎn)換成總黃酮的含量。,1.2.2.2 銀杏中萜內(nèi)酯含量的測定方法 內(nèi)酯主要以銀杏內(nèi)酯A、B、C 和白果內(nèi)酯為主。國外采用一種快速、簡便、準(zhǔn)確的測定萜內(nèi)酯含量的方法，先通過簡便的柱色譜有效地純化樣品, 直接供HPLC 分析，分析圖譜清晰，且干擾峰與待測峰能完全分離。測定結(jié)果重現(xiàn)性好, 準(zhǔn)確度高。,1.2.3 銀杏葉的采摘,應(yīng)對大規(guī)模的采摘量，主要是采用機(jī)械采收。 剛采收的葉子，含水量高，一般達(dá)70%左右，如果不及時(shí)干燥，

6、容易發(fā)霉變黃，采用大批量快速干燥技術(shù)進(jìn)行干燥。 在種植、采收、干燥加工過程中都實(shí)現(xiàn)規(guī)范化，保證原料葉的質(zhì)量。 科學(xué)的確定采摘期也是保證銀杏葉質(zhì)量的重要因素之一。,5-11月各月份生長期的銀杏葉的黃酮苷元：山奈酚、槲皮素、異鼠李素含量。,5-11月各月份生長期的銀杏葉的苷元和黃酮苷含量。,左： 5-11月各月份生長期的銀杏葉的山奈酚衍生物、槲皮素衍生物含量。,右： 5-11月各月份生長期的銀杏葉的山奈酚苷、異鼠李素苷、槲皮素苷含量,5-11月各月份生長期的銀杏葉的雙黃酮含量,Sc-金錢松雙黃酮 Isog-異銀杏雙黃酮 Gink-銀杏雙黃酮 Bil去甲銀杏雙黃酮 Am穗花杉雙黃酮,A：銀杏內(nèi)酯A，

7、GA B：銀杏內(nèi)酯B，GB C: 銀杏內(nèi)酯C，GC D: 白果內(nèi)酯A，BB,綜合因素定采摘期： 1、黃酮含量 2、內(nèi)酯含量 3、葉片大小 （5月份是葉芽，葉的體積最小，黃酮含量高，但收得率低，而且內(nèi)酯含量也低，內(nèi)酯是7月份最高。） 4、對植株生長的影響 （7月份采摘對植株的生長會(huì)產(chǎn)生不良影響）,最終確定采摘期：,一般在七月底八月初，先采摘苗木或幼齡樹的下部葉子，采葉量不可過多，一般不超過苗木的1/3或1/4。八月底九月初采中部葉子，變黃前采上部葉，采葉時(shí)，應(yīng)選擇晴天進(jìn)行。,1.2.4 日本重視藥材的規(guī)范化種植,日本漢方藥的基礎(chǔ)研究比較細(xì)致，藥材從選種、育苗開始有全程質(zhì)量跟蹤。 日本正在大建中藥

8、材種植基地，從國外引種藥材，現(xiàn)已建成了約3萬平方米的藥材科學(xué)專業(yè)種植園。 日本學(xué)者采用生物學(xué)和遺傳學(xué)的手段進(jìn)行了選拔優(yōu)良品種、育種及栽培移植方面的研究工作。,將現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)應(yīng)用到藥用植物栽培上，注意使用小型機(jī)械精耕細(xì)作，盡量不用化肥 和農(nóng)藥，以保證生藥質(zhì)量。 日本制訂了藥用植物采集管理規(guī)范（GACP）為獲取優(yōu)質(zhì)的藥用植物原料，和藥物草本植物制品的生產(chǎn)提供了一般性的技術(shù)指南。 培育了黃連、烏藥、日本當(dāng)歸等約500多個(gè)品種，其中栽培基地年產(chǎn)量可達(dá)200噸。,韓國從公元1567就開始人參的人工栽培。 多年來，韓國一直把高麗參作為拳頭產(chǎn)品，實(shí)行原料栽種加工定點(diǎn)生產(chǎn)，種植人參在指定的區(qū)域內(nèi)并規(guī)定生長

9、年限和采挖年限，有專門技術(shù)指導(dǎo)，統(tǒng)一收購后，由政府規(guī)定在唯一的紅參加工廠進(jìn)行加工再出售。 高麗參與普通作物不同，對土壤的要求非常嚴(yán)格，一般情況下收獲過一次人參的土地往往10年內(nèi)無法再次種植人參。 優(yōu)質(zhì)的高麗參，其一株，從栽種到消費(fèi)者購買之前需要長達(dá)6年以上的時(shí)間和努力。,1.2.5 韓國高麗參的規(guī)范化種植,第一步：種植地的選擇。通過土壤分析、現(xiàn)場勘查、耕種人訪談等過程選擇耕地。評價(jià)相關(guān)土地的土質(zhì)及土地的方向、坡度、位置等，采集土壤樣本進(jìn)行農(nóng)藥及重金屬污染度、土地肥沃度等19個(gè)項(xiàng)目的檢查。 第二步：栽培地的管理。相關(guān)部門通過定期進(jìn)行現(xiàn)場耕作情況調(diào)查，施行嚴(yán)格徹底的栽培狀態(tài)管理。允許使用的農(nóng)藥種類

10、只有3種，這些農(nóng)藥也都是具有撒藥3天后自然降解能力的水溶性產(chǎn)品。第三步：收購。6年根高麗參在經(jīng)兩次農(nóng)藥檢查合格并獲得適合收購判定后，就會(huì)被確定收割日期。,2、現(xiàn)代化的制藥技術(shù)設(shè)備,植物藥（中藥）提取物對生產(chǎn)條件、生產(chǎn)技術(shù)要求很高，在西方，很多先進(jìn)的提取、分離、純化和干燥設(shè)備和技術(shù)應(yīng)用于植物藥提取物的生產(chǎn)。 很多設(shè)備和技術(shù)是隨著植物藥的研發(fā)而應(yīng)運(yùn)而生，圍繞著植物藥的生產(chǎn)需求而被打造出來的。,2.1 植物藥生產(chǎn)技術(shù)： 經(jīng)典的水-有機(jī)溶劑提取法是目前國內(nèi)外使用的最廣泛的技術(shù)。很多先進(jìn)的提取、分離、純化、干燥設(shè)備和技術(shù)應(yīng)用于植物藥提取物的生產(chǎn)中。,（一）常溫超高壓技術(shù),高壓生物化學(xué)研究已經(jīng)證明：壓力達(dá)

11、到一定值，蛋白質(zhì)、多糖（淀粉、纖維素）等有機(jī)大分子會(huì)發(fā)生變性，但生物堿、低聚糖、甾、萜、苷、揮發(fā)油、維生素等小分子物質(zhì)則不發(fā)生任何變化。 超高壓提取就是利用了超高壓對生物材料的這種作用實(shí)現(xiàn)有效成分提取的。植物細(xì)胞壁上有很多微孔，因此我們可以把植物細(xì)胞壁看作是由許多微孔組成的薄膜。當(dāng)植物細(xì)胞處于溶劑中時(shí)，溶劑將通過這些微孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。 常溫超高壓提取技術(shù)可以使用多種溶劑，包括水、不同濃度的醇和其它有機(jī)溶劑，可以從不同的天然產(chǎn)物中提取不同性質(zhì)（如生物堿、黃酮、皂甙、多糖、揮發(fā)油）的有效成分。,（二）超聲波提取技術(shù),超聲波是一種高頻率的機(jī)械波。超聲場主要通過超聲空化向體系提供能量。頻率范圍在15-

12、60kHz的超聲，常被用于過程強(qiáng)化和引發(fā)化學(xué)反應(yīng)，超聲波在天然產(chǎn)物有效成分提取等方面已有了一定作用。其原理主要是利用超聲的空化作用對細(xì)胞膜的破壞，有助于有效成分的溶出與釋放，超聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶質(zhì)擴(kuò)散，同時(shí)超聲波的熱效應(yīng)使水溫基本在57，對原料有水浴作用。超聲波提取與傳統(tǒng)的回流提取、索氏提取法比較，具有提取速度快、時(shí)間短、收率高、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)。已被許多天然產(chǎn)物分析過程選為供試樣處理的手段。,（三）微波輔助提取技術(shù),微波是一種非電離的電磁輻射。微波輔助提取（Microwave Assisted Extraction，MAE）是利用微波能來提高萃取率的新發(fā)展起來的技術(shù)。微波輻射誘導(dǎo)萃

13、取技術(shù)具有選擇性高、操作時(shí)間短、溶劑耗量少、有效成分收率高的特點(diǎn)，已被成功應(yīng)用在藥材的浸出、中藥活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒24.5億次超高頻率的快速震動(dòng)，使藥材內(nèi)分子間相互碰撞、擠壓，這樣有利于有效成分的浸出，提取過程中，藥材不凝聚，不糊化，克服了熱水提取易凝聚、易糊化的缺點(diǎn)。 微波萃取技術(shù)有一定的局限性，只適宜于對熱穩(wěn)定的產(chǎn)物。,（四）超臨界流體萃取技術(shù),超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）技術(shù)是20世紀(jì)60年代興起的一種新型分離技術(shù)。20世紀(jì)80年代，由于其選擇分離效果好、提取率高、產(chǎn)物沒有有機(jī)溶劑殘留、有利于熱敏

14、性物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的萃取等特點(diǎn)SFE技術(shù)逐漸被運(yùn)用到天然產(chǎn)物有效成分的提取分離上，并且與GC、IR、GC-MS、HPLC等聯(lián)用形成有效的分離技術(shù)。 超臨界流體（SF）是指在臨界溫度和臨界壓力以上，以流體形式存在的物質(zhì)，目前研究較多、最常用的超臨界流體是二氧化碳。在超臨界狀態(tài)下將SF與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地溶解其中的某些組分。SF的密度和介電常數(shù)隨著密閉體系壓力的增加而增加，因此利用程序升壓可將不同極性的成分進(jìn)行分步提取。,（五）大孔樹脂吸附,大孔吸附樹脂是一類新型高分子分離材料，是一種高聚物吸附劑，根據(jù)其孔徑、比表面積及構(gòu)成類型分為許多型號。20世紀(jì)70年代開始用來進(jìn)行天然產(chǎn)物有效成

15、分的分離純化研究。 大孔吸附樹脂分離技術(shù)的應(yīng)用原理主要是利用大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結(jié)合的原理，從天然產(chǎn)物提取液中有選擇的吸附其中的有效成分，去除雜質(zhì)。采用大孔吸附樹脂分離純化操作的基本程序大多是：天然產(chǎn)物提取液通過大孔樹脂吸附有效成分乙醇溶液梯度洗脫回收溶劑得到提取液浸膏干燥半成品。 大孔吸附樹脂工藝對于富集天然產(chǎn)物中的黃酮類、生物堿類、苷類等有效成分是卓有成效的。,（六）膜分離技術(shù),膜分離技術(shù)是一項(xiàng)新興的高效分離技術(shù)，已被國際公認(rèn)為是20世紀(jì)末到21世紀(jì)中期最有發(fā)展前途的一項(xiàng)重大高新生產(chǎn)技術(shù)。是利用天然或人工合成的具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力，對雙組分或多組分體

16、系進(jìn)行分離、分級、提純或富集的技術(shù)。膜分離技術(shù)包括超濾、微濾、納濾和反滲透等。 膜分離技術(shù)的應(yīng)用原理近似機(jī)械篩，是以壓力為推動(dòng)力，實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)與溶劑的分離，溶劑（水）和其它小分子量溶質(zhì)透過具有不對稱微孔結(jié)構(gòu)的濾膜，大分子溶質(zhì)和微粒（如蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌、膠體等）被濾膜阻留，從而達(dá)到分離、提純和濃縮產(chǎn)品的目的。在常溫下操作，無相變，能耗低。 采用超濾技術(shù)可以濾除天然產(chǎn)物水提液中的相對分子量大于幾萬的雜質(zhì)（無效成分），如纖維素、黏液質(zhì)、樹膠、果膠、淀粉、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)（少數(shù)藥材除外）、樹脂等成分。,（七）分子印跡技術(shù),分子印跡技術(shù)（MIT）是20世紀(jì)末出現(xiàn)的一種高選擇性分離技術(shù)，這種技術(shù)是選用能與印跡分

17、子產(chǎn)生特定相互作用的功能性單體，在印跡分子周圍與交聯(lián)劑進(jìn)行聚合，形成三位交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，然后，通過合適的溶劑除去印跡分子，在聚合物網(wǎng)絡(luò)中形成空間和化學(xué)功能與印跡分子互補(bǔ)的空穴。整個(gè)聚合過程可分為三步：印跡、聚合、去除印跡分子。 例如,在極性溶劑中以丙烯酰胺作為功能單體，以強(qiáng)極性化合物槲皮素為印跡分子，制備了分子印跡聚合物（MIP）。液相色譜實(shí)驗(yàn)表明。MIP對槲皮素具有特異的親和性。將此MIP直接分離銀杏葉提取物水解液，得到主要含槲皮素及與槲皮素結(jié)構(gòu)相似化合物山奈酚兩種黃酮的組分。研究證實(shí)了MIP用于直接分離、提取植物藥中具有特定藥效化合物的可行性。,2.1.1 德國EGb761生產(chǎn)工藝,EB

18、G761與其他廠家生產(chǎn)的銀杏葉提取物的區(qū)別在于其特定的工藝和標(biāo)準(zhǔn)。 其工藝是以丙酮-水為起始溶劑進(jìn)行粗提取，再經(jīng)過脫脂除去銀杏酸、原花青素等脂溶性成分，富集二萜內(nèi)酯和黃酮類成分，經(jīng)過27道工序制成提取物。 總黃酮苷為22%-27%，總內(nèi)酯5%-7%，銀杏酸類成分5ug/g以下。,銀杏內(nèi)酯與銀杏酸在葉中的含量是相近的，提取工藝科高度富集內(nèi)酯，最大限度分離除去銀杏酸。 丙酮-水提取工藝也需脫脂，主要是除去脂溶性的銀杏酸，其脫脂工藝是三氯甲烷萃取，有污染，但在全封閉的生產(chǎn)線上，污染控制得很好。 確定丙酮-水提取工藝的重要原因：是其可以較好的提取黃酮苷及萜類成分，而乙醇-水系統(tǒng)卻較容易將致敏物質(zhì)烷基酚

19、類（銀杏酸類）成分提取出來。,工藝分析：,EGb761所含成分的組成,EGb761 的成分經(jīng)多年的數(shù)據(jù)積累（30年不罷休的研究），得到的大致比例。 植物藥的特點(diǎn)就是，不同工藝生產(chǎn)的提取物所含成分很難一致，已知的一致，未知的也不一致。 療效的發(fā)揮取決于其中的成分，成份的組成取決于提取的工藝，對于植物藥，一個(gè)工藝代表一個(gè)藥品。（工藝是藥品的代名詞）,EGb761提取工藝也存在滯后問題,生產(chǎn)EGb761的工藝是德國Schwabe 的專利工藝，而這一專利工藝限于上世紀(jì)70年代初的技術(shù)水平，生產(chǎn)工藝不盡合理（三氯甲烷萃取除銀杏酸）。 但要改變生產(chǎn)方法則又需經(jīng)過一系列科研和藥政手續(xù)，要進(jìn)行全套研究工作，實(shí)非易事。,2.1.2 日本先進(jìn)的漢方藥制劑生產(chǎn)技術(shù)： 日本把低溫提取、真空濃縮、冷凍干燥、軟水抽提、真空沸騰造粒等現(xiàn)代制藥的最新技術(shù)應(yīng)用于漢方藥的研究中，大大提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。盡量保持了原有處方煎劑的性質(zhì)，減少了有效成分的損失，實(shí)現(xiàn)了科學(xué)化的生產(chǎn)管理。 整個(gè)生產(chǎn)的過程參照漢方GMP規(guī)定，整個(gè)生產(chǎn)過程采用先進(jìn)的