植物的原生質(zhì)體培養(yǎng),主要內(nèi)容,原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體培養(yǎng)的優(yōu)越性原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的培養(yǎng),原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細胞壁的細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露球形細胞。,細胞,微絲,葉綠體,線粒體,質(zhì)膜,液泡,細胞核,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),微管,細胞壁,高爾基體,植物細胞模式圖,細胞壁由三種主要成分構(gòu)成纖維素25-50%、半纖維素53%和果膠5%,一、植物原生質(zhì)體的特點：1、吸收能力增強：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細胞器、細菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細胞壁再生并能進行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力；3、在一定條件下可誘導原生質(zhì)體融合，形成雜種細胞。4、分泌能力提高:去除了細胞壁的擴散障礙，使細胞膜的透過性增強，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5、穩(wěn)定性較差:失去了細胞壁的保護作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響。,原生質(zhì)體用途,原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義,（1）為細胞融合奠定基礎。有性雜交不能進行細胞質(zhì)交流。（2）是遺傳工程的理想受體。能夠直接攝取外源DNA，細胞器甚至微生物。（3）理論研究。細胞壁再生、細胞膜離子轉(zhuǎn)運、病毒侵染。因為細胞壁不僅具有保護功能，還參與細胞的生長和分化等生命活動。但是必須指出：原生質(zhì)體必須再生出細胞壁才能繼續(xù)發(fā)育。,二、原生質(zhì)體的制備不同的植物細胞，由于細胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有所不同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。1、用于分離原生質(zhì)體的材料準備：選取生長旺盛的細胞，幼嫩的組織。無菌試管苗葉片上胚軸和子葉培養(yǎng)細胞（愈傷組織）,2、原生質(zhì)體的分離1）、機械法：利刃機械切割2）、酶解法：果膠酶和纖維素酶處理,1）機械法,1892年首先用于藻類分離原生質(zhì)體做法：先使細胞質(zhì)壁分離，再用刀把細胞壁切破，使原生質(zhì)體流出或釋放出來。,優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。缺點：1)手工操作難度大，原生質(zhì)體得率低，費時費力，難以大量制備。2）能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。,2）酶解法,1960年英國諾丁漢大學的科金第一次用酶解法從番茄幼苗根尖中大量制備出原生質(zhì)體；常用酶：纖維素酶類、果膠酶類、半纖維素酶、蝸牛酶等；優(yōu)點：條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、得率高，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。缺點：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，影響所獲原生質(zhì)體的活力。,酶解制備原生質(zhì)體過程,1)、取材預處理2)、酶解制備3)、原生質(zhì)體收集,1）材料預處理(暗處理，預培養(yǎng)和低溫處理)在酶處理前，常把供體組織置于合適濃度的穩(wěn)壓液中，使細胞預質(zhì)壁分離約一小時后再用酶液處理。原因：預質(zhì)壁分離可使胞壁內(nèi)表層充分暴露，增加胞壁降解酶與胞壁的接觸面而提高胞壁降解速度；降低原生質(zhì)體內(nèi)電解質(zhì)滲漏，防止在分離期間外來酶被吸入細胞內(nèi)，降低原生質(zhì)體對酶液中可能存在的有害影響的敏感，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性和存活率。,A、酶溶劑及其滲透壓酶的種類酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制、PH値。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解時間：酶濃度及溫度。,2）酶解考慮因素,酶的種類和濃度,纖維素酶（Cellulase）OnozukaR-10果膠酶（Pectolyase）Y-23半纖維素酶（Hemicellulase）對幼葉來說，酶濃度較低：0.5-1纖維素酶，果膠酶(0.2-0.5);酶量少對愈傷組織、懸浮細胞：纖維素酶、果膠酶的濃度要提高到1或2。酶量大,酶液PH值：5.4-5.8，因為PH高，酶活性低；PH低，原生質(zhì)體損壞多。,酶液滲透壓,裸露的原生質(zhì)體必須維持在一定的滲透壓下，才既不漲破，又不因過度收縮而破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此在酶液中須加入滲透壓穩(wěn)定劑來代替細胞壁對原生質(zhì)體起保護作用。常用的滲透壓穩(wěn)定劑是糖醇系統(tǒng)，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。目前大多數(shù)使用甘露醇或山梨醇，它們能穩(wěn)定地維持滲透濃度。濃度一般為0.4-0.8mol/L。而蔗糖等易被原生質(zhì)體吸收利用，降低滲透濃度，故不常用。,其它,酶液中加入葡聚糖硫酸鉀、CaCl2等鹽類,保護細胞膜、提高原生質(zhì)體穩(wěn)定性和活力,酶解處理的條件光：一般黑暗下靜止進行；溫度：25，兼顧原生質(zhì)體及酶活性；時間：幾小時到幾十小時，太長不利于原生質(zhì)體的活性，一般24小時。如煙草葉片酶處理2小時后葉肉細胞解離完畢。,3）原生質(zhì)體分離過程：一步法（以煙草葉片為例）,第一步：預處理即對煙草植株限制供水第二步：取幼葉常規(guī)表面消毒后在無菌條件下剝?nèi)ネ獗砥で谐?cm的小塊第三步：制作混合酶液（纖維素酶2%和果膠酶0.5%）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2.PH5.6第四步：將小塊煙葉放入混合酶液25處理810小時第五步：過濾、離心、洗滌（0.7mol甘露醇液含0.1mmolCaCl2）。如此23次、得原生質(zhì)體,圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）,以愈傷組織為材料分離原生質(zhì)體。,以葉片為材料分離原生質(zhì)體。,3、原生質(zhì)體的收集和純化：,酶解處理后得到混合液包括原生質(zhì)體、細胞團和組織碎片等，必須將雜質(zhì)和酶液除去，才可以繼續(xù)培養(yǎng)。原生質(zhì)體純化方法有：離心沉淀法，漂浮法，接口法。,1）離心沉淀法篩網(wǎng)過濾（400目）除去未消化的細胞、細胞團和碎片后在適當試劑（甘露醇）內(nèi)低速離心。優(yōu)缺點：比較簡單但不易除盡一些完整的細胞，或引起原生質(zhì)的破碎,2）飄浮法據(jù)原生質(zhì)體比重小能在一定滲透壓的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。優(yōu)缺點：可以得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少。3）沉淀法和飄浮法結(jié)合先沉淀后漂浮，重復操作，純化后可用于培養(yǎng)或細胞融合。,4）接口法（界面法）,采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液的密度小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體介于兩種溶液之間。優(yōu)缺點：可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。,以柑桔為例,原生質(zhì)體分離純化流程圖,目的：檢驗獲得的原生質(zhì)體是否真正的原生質(zhì)體鑒定方法(針對有無細胞壁)：,4、原生質(zhì)體鑒定,低滲爆破法：原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水脹破，觀察有無細胞壁碎片；,熒光染色法：通過熒光增白劑染色后離心去除多余染料，在熒光顯微鏡下觀察（波長3600-4400），綠光顯示有纖維素，紅光示真正的原生質(zhì)體。,5、原生質(zhì)體活力檢測,染色法FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細胞質(zhì)膜，被活細胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴重損壞使細胞被染色。胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力；滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會隨著外界滲透壓的變化體積變化。氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無光呼吸耗氧。,6、影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)；酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓；分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間；環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響。,二、原生質(zhì)體的培養(yǎng),（一）培養(yǎng)基1滲透壓：原生質(zhì)體的滲透壓原則是培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲。常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。2無機鹽3有機成分：維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4激素：常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D5pH值,（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法,液體淺層培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體固體雙層培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng),（三）影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素,基因型：如番茄與秘魯番茄有性雜交后對性狀分離的遺傳分析，證明其愈傷組織的再生能力是2個顯性基因所決定；原生質(zhì)體的來源：供體材料體類型、供體細胞的分化程度、供體細胞的生長同步性；起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基：基本起始密度、培養(yǎng)基激素水平、密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性。,三、原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生,完整細胞,一般包括如下幾個步驟：1）細胞壁再生：體積膨大，葉綠體重新排列，新的細胞壁開始合成，細胞由球形變成橢圓形。,2）分裂：一般在培養(yǎng)2-3天后細胞質(zhì)增加，細胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細胞分裂，形成小的細胞團，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。3）植株再生,第一次分裂,第二次分裂,第三次分裂,多細胞團,肉眼可見細胞團,愈傷組織,愈傷組織,植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的應用,1、利用原生質(zhì)體融合獲得融合細胞2