1、    小鼠靜脈內(nèi)注射白細(xì)胞介素8對動員骨髓造血干/祖細(xì)胞的作用研究        摘要目的： 研究重組人白細(xì)胞介素8(rhIL-8)動員小鼠造血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。方法60Co射線照射)的BALB/c小鼠，觀察其造血重建功能。結(jié)果：每只小鼠單獨注射rhIL-8 30g 15分鐘后，外周血中混合細(xì)胞集落形成單位(CFU-Mix)數(shù)量達(dá)峰值(194±61)×10/L，比對照組(7±3)×10/L明顯升高；外周血中c-kit Sca-1

2、細(xì)胞為(3186±517)×10/L，亦比對照組(644±341)×10/L明顯升高；聯(lián)合注射rhG-CSF則可使外周血CFU-Mix和c-kitSca-1細(xì)胞分別增高至(790±48)×10/L和(10729±2339)× 10/L。單獨注射rhIL-8后動員的PBMNC回輸給致死性照射的BALB/c小鼠，其外周血中骨髓造血重建活性(MRA)細(xì)胞比對照組明顯升高，聯(lián)合rhG-CSF組外周血中MRA細(xì)胞數(shù)可達(dá)(356.3±87.7)× 10/L。結(jié)論：rhIL-8可單獨或協(xié)同G-CSF快速動員骨

3、髓造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血。關(guān)鍵詞白細(xì)胞介素8粒細(xì)胞集落刺激因子造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞移植Effect of intravenous injection of interleukin-8 on mouse hematopoietic progenitor cell mobilizationZhang Yi, Zhu Jiankun, Zhang Yanyun,et al.Immunology Research Unit, Suzhou Medical College, Suzhou215007AbstractObjective： To study the mobilization effects

4、 of recombinant human IL-8(rhIL-8) on mouse peripheral blood hematopoietic progenitors (HPCs). Methods:A daily single dose of rhIL-8 was intravenously injected into normal or G-CSF-treated mice for two days. The number of colony-forming unit-Mix (CFU-Mix) in peripheral blood was analyzed by colony a

5、ssay, while the number of c-kitSca-1 HPCs was examined by immunofluorescence staining. In addition, colony forming unit of spleen (CFU-S) and marrow repopulating ability (MRA) cells were examined by transplanting lethally irradiated mice. Results: Single dose of rhIL-8 (30g) significantly increased

6、the numbers of CFU-Mix(194±61)×10/L and c-kit Sca-1 cells (3186±517)×10/L in the peripheral blood as compared with that of normal saline controls (7±3)×10/L and (644±341)×10/L at 15 minutes after intravenous injection. G-CSF could also increase peripheral CFU-

7、Mix and c-kit Sca-1 cells to (790±48)×10/L and (10729±2339)×10/L, respectively, after subcutaneously injection for two days, this increase was further augmented by rhIL-8 injection. IL-8 alone or in combination with G-CSF could significantly increase the number of CFU-S and MRA c

8、ells in circulating blood. Conclusion: IL-8 alone or in combination with G-CSF could significantly mobilize circulating HPCs. Key wordsInterleukin-8Granulocyte-colony stimulating factorHematopoietic stem cellsHematopoietic stem cell transplantation白細(xì)胞介素8(IL-8)是細(xì)胞趨化因子家族成員之一1。近年的研究表明，單劑量注射IL-8可快速動員造血干

9、/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血2。目前臨床廣為應(yīng)用的造血干/祖細(xì)胞動員劑是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。但體內(nèi)注射G-CSF所需時間長(710天以上)、費用高，同時須連續(xù)監(jiān)控體內(nèi)循環(huán)血中造血干/祖細(xì)胞的水平。為尋找更佳的造血干/祖細(xì)胞動員的方法，我們探討了IL-8與G-CSF聯(lián)合動員造血干/祖細(xì)胞的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)，為臨床進(jìn)一步開展有關(guān)研究工作提供理論及實驗依據(jù)。 材料和方法1細(xì)胞因子和抗體重組人IL-8由本室制備3。重組小鼠IL-3、IL-6和抗小鼠c-kit單克隆抗體(ACK-2)由日本東京大學(xué)Matsushima教授贈，重組小鼠干細(xì)胞刺激因子(SCF)由北京醫(yī)科大學(xué)馬大龍教授贈，重組人紅細(xì)胞生成素

10、(Epo)由第二軍醫(yī)大學(xué)贈，G-CSF為日本中外制藥產(chǎn)品。Sca-1抗體購自Pharmigen公司。2實驗動物812周齡的健康雌性BALB/c近交系小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，并飼養(yǎng)于本院實驗動物中心。動物分組，每組10只小鼠。3小鼠外周血（PB）及骨髓(BM)單個核細(xì)胞(MNC)的制備按本室常規(guī)方法進(jìn)行4。小鼠經(jīng)氯仿麻醉后，于無菌狀態(tài)下，經(jīng)心臟穿刺取血并定量；小鼠骨髓來源于脛骨和股骨。上述細(xì)胞經(jīng)肝素(25U/ml)抗凝，進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)和分類，采用Ficoll-Hypague(相對密度為1.077)離心取PBMNC和BMMNC，洗滌后備用。4小鼠外周血c-kit Sca-1細(xì)胞數(shù)

11、的檢測按文獻(xiàn)5進(jìn)行。5造血干/祖細(xì)胞的集落培養(yǎng)按本室常規(guī)法5進(jìn)行。簡述其過程如下：半固體培養(yǎng)基含0.9%甲基纖維素，20%胎牛血清，1%脫離子牛血清清蛋白(Sigma公司)和各類造血生長因子(IL-3,SCF, IL-6,G-CSF和Epo)的組合。細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10/ml PBMNC或5×10 /ml BMMNC,充分混合后，加入24孔板，每孔0.5ml，每組設(shè)8個復(fù)份，置5% CO，37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，于倒置顯微鏡下計數(shù)混合造血干/祖細(xì)胞集落形成數(shù)(CFU-Mix)，經(jīng)換算后以每升外周血中所含CFU-Mix顯示結(jié)果。6脾集落形成單位(CFU-S)和骨髓造血重建

12、活性(MRA)實驗按本室常規(guī)法進(jìn)行460Co 射線照射后(劑量率為0.7Gy/min)，由尾靜脈注射2×10 PBMNC，無菌飼養(yǎng)12天后，用氯仿麻醉處死，計數(shù)外周血和骨髓中有核細(xì)胞總數(shù)及MNC數(shù)；分離脾臟，浸于Telleyesnizkys溶液(70% 乙醇乙酸甲醛=2011)，計數(shù)脾臟表面的白色結(jié)節(jié)數(shù)即CFU-S。同時，取5×10 BMMNC經(jīng)尾靜脈再次注射給第2組致死性輻射小鼠，觀察其外周血有核細(xì)胞數(shù)和CFU-S數(shù)，以分析重建長期造血功能的造血細(xì)胞數(shù)。結(jié)果1單劑量腹腔內(nèi)注射IL-8可動員小鼠外周血造血干/祖細(xì)胞給每只BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射不同劑量IL-80(即生理鹽

13、水)，5，10，30，100g后，于15分鐘時取外周血，作CFU-Mix測定。結(jié)果顯示，IL-8劑量低于10g時，對外周血中CFU-Mix的數(shù)量無影響，當(dāng)IL-8劑量為30g時，其外周血中的CFU-Mix數(shù)量達(dá)最高值，由生理鹽水對照組的(7±3)×10/L顯著上升至(194±61)×10/L(P<0.001)，增加了約27.7倍，揭示單劑量IL-8注射即可有效地動員造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血。2IL-8動員小鼠外周血造血干/祖細(xì)胞的時間動力學(xué)給每只BALB/c小鼠注射30g IL-8 后，于不同時間點(0，5，15，45，90，120和240分鐘)，

14、測定外周血中的CFU-Mix數(shù)。結(jié)果表明，IL-8注射后外周血中CFU-Mix數(shù)量于1530分鐘達(dá)到高峰(見附)，外周血中白細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)增多，由(13.6±4.1)×10/L升高至45分鐘時的(24.7±6.8)×109/L，并持續(xù)達(dá)120分鐘以上。值得注意的是，IL-8注射后5分鐘時外周血中桿狀核粒細(xì)胞比例由對照組的0.12顯著升高至0.17，并于45分鐘達(dá)到高峰至0.64，提示骨髓貯存池中相對不成熟的粒細(xì)胞也被動員至外周血中，該結(jié)果與上述CFU-Mix的變化恰好吻合。3G-CSF體內(nèi)注射聯(lián)合單劑量IL-8對造血干/祖細(xì)胞的動員作用按常規(guī)給藥方案，于

15、小鼠皮下注射G-CSF，每次2.5g，每日2次。2天后，單劑量注射IL-8，每只鼠30g，15分鐘后，取外周血，測定CFU-Mix。結(jié)果顯示：G-CSF單獨注射2天后，小鼠外周血中CFU-Mix數(shù)量顯著升高，聯(lián)合IL-8單劑量注射后，外周血CFU-Mix數(shù)量進(jìn)一步升高至(790±48)×10/L(P<0.01，表1)，增加了約3倍。    附IL-8動員外周血造血干/祖細(xì)胞的時間效應(yīng)體內(nèi)研究顯示，注射單劑量IL-8可顯著提高外周血中CFU-S數(shù)，而G-CSF注射2天后，外周血中CFU-S數(shù)增加幅度不明顯，但協(xié)同IL-8注射后，外

16、周血中CFU-S數(shù)顯著升高(P<0.01)。進(jìn)一步證實IL-8可顯著提高G-CSF動員外周血造血干/祖細(xì)胞的效率(表1)。表1單劑量IL-8和(或)協(xié)同G-CSF體內(nèi)注射對造血干/祖細(xì)胞的動員作用組別CFU-Mix(×10/L)CFU-S(×10/L)對照組21±3IL-8組373±55*G-CSF組265±17*G-CSF+IL-8組790±48*     鼠數(shù)為810；*與對照組比，P<0.01 4IL-8協(xié)同G-CSF動員的造血干/祖細(xì)胞對受輻照小鼠造血重建的影響進(jìn)一步實驗研究

17、顯示，單劑量IL-8注射可顯著增加外周血中c-kit+Sca-1+細(xì)胞數(shù)和MRA細(xì)胞數(shù)(表2)，同時聯(lián)合G-CSF使用時，單劑量IL-8可進(jìn)一步快速而有效地升高循環(huán)血中c-kit+Sca-1+細(xì)胞數(shù)和MRA細(xì)胞數(shù)(P<0.001)。討論外周血作為造血干細(xì)胞池的重要組成部分，因其具有采集時操作方便、有效，患者無痛苦，以及移植外周血造血干/祖細(xì)胞后能較快恢復(fù)受者外周血血小板水平等優(yōu)點，正被臨床廣泛接受，用于替代骨髓移植2。表2IL-8動員的小鼠外周血中c-kit Sca-1細(xì)胞和MRA數(shù)變化組別c-kitSca-1細(xì)胞數(shù)(×10/L)MRA細(xì)胞(×10/L)對照組IL-8

18、組*G-CSF組*IL-8+G-CSF組*     鼠數(shù)為810；*與對照組相比，P<0.01G-CSF是一種有效的造血干/祖細(xì)胞動員劑，但是體內(nèi)注射G-CSF仍存在許多不足之處，如：所需時間長、劑量大(>500g/d)、費用高，一般患者無法接受；需定時監(jiān)測外周血中造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量；異基因移植時，健康人不易接受G-CSF的注射等，因而給外周血干細(xì)胞移植的廣泛開展帶來了一定的困難。化療藥物也可加速造血干/祖細(xì)胞的動員，但因其化學(xué)毒性和誘導(dǎo)突變性，在臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用。本研究顯示IL-8可有效動員具有長期造血活性的c-kit+Sca-1+造血干

19、/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血，其作用特點是：快速：在IL-8注射后1530分鐘即達(dá)到高峰并持續(xù)45分鐘左右；高效：使外周血中造血干/祖細(xì)胞數(shù)增加27倍左右，所動員的造血干/祖細(xì)胞具有恢復(fù)骨髓造血重建的活性；可重復(fù)性好，其動員作用的時間穩(wěn)定，不需要對外周血造血干/祖細(xì)胞作長期的監(jiān)測。這些優(yōu)點恰好與目前臨床廣泛應(yīng)用的G-CSF互補。同時IL-8可協(xié)同G-CSF有效地動員造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血，使外周血中造血祖細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增加，其骨髓造血重建活性細(xì)胞數(shù)增加55倍之多，表明IL-8協(xié)同G-CSF不僅有效地提高了單因子作用時的動員效率，而且大大縮短了G-CSF的注射時間及所需劑量，減少了費用。這樣可有效彌補長時

20、間大劑量G-CSF應(yīng)用所帶來的不足，提高了造血干/祖細(xì)胞動員的效率，為進(jìn)一步研究多種因子聯(lián)合動員造血干/祖細(xì)胞的最佳配伍及臨床應(yīng)用方案，提供了新的實驗數(shù)據(jù)。 本課題受江蘇省科委優(yōu)秀青年教師基金(BQ96016)和國防科工委基金(Y5573162-02)資助作者單位：215007蘇州醫(yī)學(xué)院免疫研究室(張毅、張雁云、劉繼明、邱玉華、李新燕、劉蓓嶺、謝煒、鄭列琳、郭玲、朱學(xué)東、張學(xué)光)；蘇州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室(朱劍昆)；蘇州市第二人民醫(yī)院檢驗科(馮麗瑾)；蘇州醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所(強亦忠)參 考 文 獻(xiàn)1Yashimura TK,Matsushima S,Tanaka S, et al.Purification