1、PNAS August 6, 2002 vol. 99 no. 16 10871文獻摘要引言材料與方法結果討論目錄 由植物適應氧化應激(脅迫)的分子機制了解甚少。為了鑒定該適應的過程，我們對煙草葉片適應氧化應激進行了基因表達的綜合分析。結合mRNA差異顯示和cDNA陣列分析，我們估計至少有95個基因在煙葉適應氧化應激過程中它們的表達會改變，其中83 被誘發(fā)，17被抑制。 53個序列標簽序列分析表明，除了抗氧化基因，與生物和非生物脅迫的防御、細胞保護和解毒、能量和碳水化合物的代謝、新蛋白的合成和信號轉導等相關的基因表達也被改變。大部分基因的表達增強，但是除了與光合作用和光調節(jié)過程相關的基因被抑制

2、了。摘要 在植物適應氧化脅迫過程中，觀察到共調節(jié)基因的兩個不同的群體（“早期” 和“晚期響應”基因調節(jié)子），這表明至少有兩個不同的基因誘導途徑的存在。這兩個基因調節(jié)子對氧化應激也表現(xiàn)出的兩種不同的表達模式。在適應脅迫的葉片部位“后期響應”基因表達增強，而“早期反應”基因的表達則不是?？傊覀兊臄祿砻?，對氧化應激的適應是與廣泛的基因表達的調節(jié)相關聯(lián)的一個非常復雜的過程。此外，我們的數據表明，除了防衛(wèi)基因誘導，植物過敏加強了基因表達可能是適應氧化應激的一個重要因素。 植物處于非致死的生物或非生物脅迫時，通常會呈現(xiàn)對一般的，劑量相同的致死因子的耐受性，而這種現(xiàn)象被稱為馴化（適應）或獲得抗病性。這

3、種誘導產生的脅迫抗性并不限于同一類型的脅迫，也有關于不同的應激之間的交叉耐受性的相關報道。由于許多脅迫條件導致細胞氧化還原失衡，有研究表明植物對氧化應激的防御有助于誘導對非生物和生物脅迫的耐受性，而且是交叉耐受性介導的關鍵成分。有個現(xiàn)象也說明這個概念，即適應熱或冷的植物會呈現(xiàn)對病原體的抗性并對氧化應激產生更高的耐受性。引言 抗氧化防御反應主要是增強抗氧化酶活性和增加抗氧化代謝物的水平，如抗壞血酸，谷胱甘肽，-生育酚和類胡蘿卜素。最近更多研究發(fā)現(xiàn)，誘導小熱激蛋白，細胞保護基因谷胱甘肽轉移酶（GST）和發(fā)病機理相關基因PR2都與對氧化脅迫的耐性相關。 對各種氧化劑的適應反應已在細菌和酵母中被廣泛研

4、究。在細菌中，通過亞致死劑量的氧化應激產生了至少80種蛋白，并觸發(fā)對致死的氧化脅迫的耐受性，而酵母中至少有900個基因的表達受到影響。為了解更多氧化應激使植物獲得抗性的分子機制，我們用mRNA差異顯示分析煙草葉片對氧化應激的基因表達的變化。本研究顯示了該過程的高度復雜性，并揭示了其基因和機制，為氧化脅迫耐性的研究做出貢獻。1 1、植物植物材料、培養(yǎng)條件和甲基紫材料、培養(yǎng)條件和甲基紫精精 ( (MVMV) ) Methyl Methyl ViologenViologen處理處理 在100mol m-2s-1的光子通量下，16小時的光照和8小時的黑暗，70%的相對濕度，恒溫24C的條件下生長5周，

5、不同的植物中切出3個直徑1cm的圓孔，近軸端施用12ml的甲基紫精溶液，對照組使用超純水。使用電導儀測定葉盤離子滲漏溶液的導電性。2 2、 RNA RNA提取和提取和RNARNA凝膠印記凝膠印記分析分析3、差異顯示差異顯示4、 DNA序列分析序列分析材料和方法1、煙草煙草對甲基紫精的對甲基紫精的敏感性敏感性為了鑒定植物中基因對適應氧化脅迫的差異表達，使用MV。雖然低濃度的AOS誘導防御反應，但高濃度的AOS導致細胞死亡。為了避免細胞惡化基因的表達，我們首先確定亞致死MV的濃度。為此，煙草葉盤上用不同濃度的MV，并監(jiān)測溶質的電導率。結果相比用水處理過的葉盤，0.2 M和較低濃度的MV只造成較小的

6、離子滲漏，即使經過42小時的培養(yǎng)也并沒有觀察到明顯的損傷，（圖1）。在隨后的實驗中，上述濃度的MV用于誘導對氧化應激的耐受性。大于0.2M的濃度導致了大量的離子滲漏和細胞死亡（圖1），并用于評估植物對氧化脅迫的耐受性。2 2、亞致死劑量的亞致死劑量的MVMV處理使得煙草葉片對致死劑量的處理使得煙草葉片對致死劑量的MVMV誘導的氧化脅迫產生適應性誘導的氧化脅迫產生適應性。 使用0.2M MV或更低濃度（預處理）各種時期的煙草葉盤隨后轉移到含有致命劑量的MV溶液中做耐受性評估（處理）。當葉盤用0.1M MV進行預處理17小時（含8小時黑暗期）并在一個11小時的處理后進行抗逆性評估，煙葉對MV的抗性

7、非常顯著（與水處理的對照組，實驗組溶質電導率減少了40 ）（圖2A ）。為了測試這種對MV的耐性究竟不僅僅只是一種生理反應，還涉及核基因表達的改變，通過Northern雜交檢測mRNA水平的抗氧化基因GPX和SodCc被檢測。0.1M MV預處理的葉片中這兩種抗氧化基因都被誘導，并且在整個氧化應激的適應期樣品中它們的的表達增強了（圖2B）。這一觀察結果表明，煙葉對 MV強加的氧化脅迫不僅是一種生理反應，還涉及核基因表達的改變，說明GPX和SodCc起到增強耐受性的作用。3 3、對耐藥性的煙葉做全基因組表達分析。對耐藥性的煙葉做全基因組表達分析。 為了闡明氧化脅迫耐受性增強的的分子過程，進行了全

8、基因組表達分析。通過mRNA差異顯示技術對無論是水或0.1MMV預處理17小時的煙草葉盤進行了對比。用80個引物組合，耐受性和無耐受性的樣品中始終差異表達的大于150 bp的243個帶（表1）被鑒定出來。對146個帶的序列分析表明，50 的頻帶是含有兩個或更多不同的cDNA片段的混合體。因此，源于這146個帶的單一序列被重新擴增，擺著尼龍膜上，并與來自耐受性和無耐受性的煙草葉盤中的cDNA探針雜交。 對13個誘導表達的基因進行了測試，并通過RNA凝膠印跡分析來重新確認，驗證cDNA微陣列分析的結果。4 4、氧化應激處理過程中誘導基因的差氧化應激處理過程中誘導基因的差異表達異表達 對0.1MMV

9、預處理（馴化）和隨后的1MMV處理過程中的11個選擇的基因的表達進行了分析（氧化應激，圖3）。在預處理的第一個4小時，除了多功能蛋白（MFP）和脂氧合酶2（LOX2）的基因密碼被誘導外，水和MV預處理的樣品中并沒有明顯的誘導基因表達，可能是葉盤正在適應的結果。經過12小時后，暴露在0.1MMV中的樣本所有的基因被誘導。然而，在這個時間點，感應還是相當低，可能反映了前8小時的黑暗期（無光合活性）需要由MV積累最大量的超氧化物。最后5小時在光照下的預處理過程增強了mRNA的誘導。 在隨后的1M MV處理，無耐性的樣品中的所有基因被誘導并且產生耐性的樣品中（ forLox2除外）的基因被進一步誘導。

10、一組基因（EAS ， TPK， LOX2 ，和MFP ）被1M MV迅速誘導（3和6小時之間達到峰值），并且這兩個未處理和預處理過的樣品在相同的水平（圖3）。在基因的第二組（ PRB- 1b中， CBP20 ，VS MDR ， DNAJ ，和WRKY11 ），感應是相當緩慢的，無耐受性的樣品在6和9小時之間達到最大表達水平，適應的樣品中是3和6小時?；虻牡诙M中適應的樣品表達明顯要高，1M MV處理后至少6小時，也不像非適應樣本中的那么高。測試的所有基因的轉錄水平在處理結束后下降。在抗氧化基因GPX和SodCc中觀察到類似的表達模式（圖2 ）。5、通過聚類分析確定基因共表達的兩個主要調控子通

11、過聚類分析確定基因共表達的兩個主要調控子。 通過MV氧化應激處理過程中挑選出來的基因的差異表達表明，可能是由不同途徑來激活基因。為了探討這種可能性，在0.1M MV預處理過程中進行更詳細的基因表達分析。 基于基因表達譜，兩個共調節(jié)基因（調控子）的大型集群被鑒定出來（圖4）。一個集群（圖4A）含有的基因它們的表達在預處理15小時結束前達到高峰，然后下降（早期反應基因）。第二個簇（集群）（圖4B）的基因的表達仍然很高，持續(xù)到預處理結束時（晚期反應基因）。有趣的是，在氧化應激處理過程中耐受性葉盤表達增大的基因（ PRB- 1b中， CBP20 ，VS MDR ， DNAJ ， WRKY11 ，谷胱甘

12、肽過氧化物，和ATPCL ）都屬于晚期反應基因簇，而其他（EAS ， TPK ， LOX2和MFP）是早期反應基因簇的一部分。基因的聚類表明，它們由相同的信號通路調節(jié)類似的細胞過程中的功能。因此，耐受性煙草葉盤中被誘導的基因的表達可能通過一個MV-依賴的方式來調節(jié)包括至少兩種不同的的信號轉導通路，并且兩組共調節(jié)基因可能在氧化應激的適應中扮演特異的角色。 為了表述植物中與氧化脅迫耐性相關的分子反應特征，我們對適應氧化應激的煙草葉盤進行全基因組基因表達分析。當我們用mRNA差異顯示時，我們發(fā)現(xiàn)耐受性葉盤中至少有95個基因表達增強了大約2倍。通過已測序的146條帶對總共4712條帶進行評分來顯示53

13、70不同的mRNA。因此，基于這個亞群的基因的分析，預測在已適應葉盤中有1.8 的煙草基因改變了它們的表達。這些數據與Desikanet等人的結果相似，他們發(fā)現(xiàn)的擬南芥暴露于過氧化氫后有2.1的基因的表達改變了1.5倍。討論 在煙草中發(fā)現(xiàn)了與已知或預測的序列相似的27cDNA片段，占所有測序cDNA的50 。高百分比的cDNA但在序列數據庫中并無同源性可能是由于分離的cDNAs主要包含3 非翻譯區(qū)，而該序列的差異非常高造成的。在這些分離的基因片段中，我們鑒定的基因和先前與耐受性相關的氧化應激（表2）基因并無聯(lián)系。其中幾個已經注釋出或可以預測到有細胞保護或解毒功能，例如，多藥耐藥基因MDR編碼A

14、BC轉運蛋白可以排出在哺乳動物細胞中的兩親性的藥物和有毒的代謝產物， DNAJ編碼一種分子伴侶， EH - 1編碼環(huán)氧化物水解酶，作用是轉化反應活性高的環(huán)氧化物水解為無害的二醇。植物解毒反應，集中在被氧化的細胞分子，但也會還集中到MV本身所在位置，因此，植物細胞中低水平的MV也可增強植物對MV解毒反應。 基因編碼的苯丙烷途徑（ ISI10a ， CCoAOMT基因，和LDOX ）和萜類植物抗毒素的途徑（ MVD ， EAS ， andVS ）的酶也誘導葉盤產生耐受性。通過這些酶產生的代謝產物，即東莨菪苷，木質素，木脂素，花青素，和倍半萜，一直主要牽涉到對病原體和UV的防御反應，其中不少也可以作

15、為抗氧化劑。 基因編碼的葉綠體（ Ycf3 ， AGP）和線粒體（ UCP ，丕轉運）蛋白的表達也受到MV預處理的影響，這表明對氧化應激的耐受性可能需要生理的適應。 Ycf3 mRNA編碼一個與光系統(tǒng)相關的葉綠體蛋白質的水平下降，就如同mRNA編碼的ADP -葡萄糖焦磷酸化酶（ AGP） 。光合作用相關基因的下調的可能會使光合作用推遲，其中多發(fā)生在脅迫條件下和從葉綠體電子傳輸鏈產生的AOS（烯基磺酸鹽）。 光合作用一系列相關的基因的下調也在過氧化氫處理過的擬南芥細胞中觀察到。在線粒體中，這是環(huán)境脅迫條件下AOS的重要來源， AOS的產生可通過線粒體呼吸鏈和膜電位解偶聯(lián)的手段來抑制。在耐受性葉盤

16、中，增強了轉錄產物編碼一個假定的線粒體解偶聯(lián)蛋白（ UCP ）的能力。總之，這些數據表明，電子傳遞鏈的AOS形成的減少是植物適應氧化應激的另一種方式。 耐受性煙草葉盤中抗菌基因（ PRB1b ， CBP20 ，和Chitinase4 ）被誘導。從活性氧產生H2O2是感應識別這些病原體基因的信號，這可以解釋為什么在誘導性耐受煙葉組織中存在H2O2。 生物和非生物脅迫產生的獲得性免疫耐受性一般認為是馴化組織從生理適應及防衛(wèi)基因和蛋白質的誘導造成的。大多數基因，包括抗氧化和細胞保護基因，不僅誘導馴化葉盤，在嚴重的氧化應激過程中也會增強馴化葉盤中的表達。即使在長期暴露在MV中，通過亞致死劑量的預處理的敏感植物表現(xiàn)出更強的基因誘導了。一些防御基因表達的增強作用已經在先前的脅迫或應激激素預處理中被觀察到，認為這些基因造成了預處理的植物對生物和非生物脅迫產生耐受性。 在這里，我們已經表明，對氧化應激的耐受過程涉及不同組防御基因的協(xié)同增效。綜合結果表明，應激調控通路迅速、高效的基因表達可能是造成耐受脅迫的基本要素之一。 亞致死濃度的MV預處理來敏化植物具有更高的基因表達，從而表明AOS（烯基磺酸鹽）也可以增強基因的表達。 氧化