1、腫瘤生物治療進(jìn)展腫瘤生物治療進(jìn)展- -細(xì)胞治療細(xì)胞治療山東大學(xué)藥學(xué)院 張建 一、腫瘤生物治療概念的演變一、腫瘤生物治療概念的演變 手術(shù)治療、放射治療（放療）、化學(xué)治療（化療）是應(yīng)用機(jī)械、物理和化學(xué)的原理來治療腫瘤. 生物治療生物治療是應(yīng)用生物大分子（細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)和肽）或調(diào)節(jié)生物反應(yīng)的小分子化合物來治療腫瘤。1894,William B.Coley,1894,William B.Coley,紐約外科醫(yī)生紐約外科醫(yī)生一位廣泛擴(kuò)散的肉瘤患者，其一位廣泛擴(kuò)散的肉瘤患者，其腫瘤部位發(fā)生鏈球菌感染腫瘤部位發(fā)生鏈球菌感染腫瘤完全消退腫瘤完全消退是否是由于鏈?zhǔn)欠袷怯捎阪溓蚓腥径鴮?dǎo)球菌感染而導(dǎo)致腫瘤消退

2、呢？致腫瘤消退呢？January 12, 1862 April 16, 1936A storyColey Coley 采取了大膽的行動(dòng)采取了大膽的行動(dòng)! !注射活的鏈球菌注射活的鏈球菌治療沒有治愈希望的、不能手術(shù)的肉瘤患者治療沒有治愈希望的、不能手術(shù)的肉瘤患者腫瘤完全消退腫瘤完全消退! !滅活的鏈球菌和變形桿菌的混合物滅活的鏈球菌和變形桿菌的混合物（ColeyColey毒素）毒素）對(duì)對(duì) 1000 1000 患者治療，約患者治療，約40%40%的到明顯的治療效果的到明顯的治療效果Coley Coley 與他的女兒與他的女兒 Dr.Helen Coley NautsDr.Helen Coley N

3、auts 利用細(xì)菌成分活化免疫系統(tǒng)，可以誘導(dǎo)部分晚期腫瘤患者的持續(xù)緩解!ColeyColey是腫瘤生物治療的鼻祖是腫瘤生物治療的鼻祖 現(xiàn)代腫瘤生物治療起始于1986年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)干擾素上市。 抗病毒抗腫瘤 腫瘤的發(fā)生 癌基因突變/抑癌基因缺失或基因表達(dá)調(diào)控失常，腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路與正常細(xì)胞的信號(hào)通路存在一定的差異。 生物治療生物治療借助腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的差異，以核酸、蛋白、細(xì)胞和小分子化合物為治療介質(zhì)，以腫瘤特異性信號(hào)通路為主要作用靶點(diǎn)，發(fā)展腫瘤選擇性強(qiáng)、毒副反應(yīng)低、高治療指數(shù)的治療技術(shù)和藥物。 有足夠的臨床證據(jù)表明，生物治療不僅能治療臨床可見的腫瘤，而且能延長(zhǎng)腫

4、瘤患者的生存期，改善預(yù)后。 這種治療水平保障了生物治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種腫瘤治療策略。二、生物治療技術(shù)和藥物分類二、生物治療技術(shù)和藥物分類 目前已用于臨床的生物治療技術(shù)和藥物主要包括： 細(xì)胞因子 單克隆抗體 免疫效應(yīng)細(xì)胞 免疫刺激劑 基因藥物和免疫毒素 作用于特定分子靶點(diǎn)的非細(xì)胞毒性小分子藥物三、免疫系統(tǒng)在抗腫瘤中的作用三、免疫系統(tǒng)在抗腫瘤中的作用結(jié)核菌葡萄球菌流感脊髓灰質(zhì)炎寄生蟲：絳蟲瘧原蟲蠕蟲攻擊攻擊防御防御免疫系統(tǒng)-人體的防御體系 清除細(xì)菌、病毒、外來異物； 消除體內(nèi)衰老細(xì)胞以及發(fā)生突變的細(xì)胞(有的突變細(xì)胞會(huì)變成癌細(xì)胞)。 對(duì)于健康的人來說，其免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大足以及時(shí)清除突

5、變的癌細(xì)胞。機(jī)體免疫系統(tǒng)和癌細(xì)胞相互作用的結(jié)果決定了癌癥的最終演變。清除期平衡期逃逸期 對(duì)于癌癥病人來說，普遍存在免疫系統(tǒng)低下，不能有效地識(shí)別、殺滅癌癥細(xì)胞;另一方面，癌癥細(xì)胞的大量增殖會(huì)進(jìn)一步抑患者的免疫功能，而且癌癥細(xì)胞有多種機(jī)制來逃脫免疫細(xì)胞的識(shí)別與殺傷。 1.1.什么是免疫？什么是免疫？ 我們生存在一個(gè)充滿復(fù)雜感染源的、敵對(duì)的世界里，我們的機(jī)體可以利用許多機(jī)制來防御外來微生物的侵襲，保護(hù)機(jī)體健康，這種防御能力被稱為免疫免疫。 免疫的類型 天然免疫反應(yīng)：天然免疫反應(yīng)：先天就具備的對(duì)某種病原先天就具備的對(duì)某種病原體的免疫力體的免疫力, ,具有遺傳性，是機(jī)體抵御病原具有遺傳性，是機(jī)體抵御病原

6、體侵襲的第一道防線；體侵襲的第一道防線； 獲得性免疫反應(yīng)獲得性免疫反應(yīng)：后天獲得、具有針對(duì)性：后天獲得、具有針對(duì)性、具有免疫記憶性。、具有免疫記憶性。 2.2.免疫系統(tǒng)的組成免疫系統(tǒng)的組成 免疫器官：骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、小腸集合淋巴結(jié)、闌尾等； 免疫組織：消化道、 呼吸道粘膜內(nèi)存在的許多無(wú)被膜的淋巴組織； 免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞等 免疫分子：補(bǔ)體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等 3.3.免疫系統(tǒng)分布免疫系統(tǒng)分布免疫系統(tǒng)功能免疫系統(tǒng)功能4. 發(fā)揮免疫應(yīng)答的成員？免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞免疫分子免疫分子 天然免疫系統(tǒng)： 肥大細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、中性/嗜堿性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞

7、； 特異性免疫細(xì)胞： T細(xì)胞、B細(xì)胞對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌（即吞噬以及消化），并激活淋巴細(xì)胞或其它免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。在抗腫瘤免疫中，巨噬細(xì)胞具有抗原遞呈功能，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。作為清道夫細(xì)胞清除機(jī)體死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片。巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞（M ）在不同組織中其名稱不同粒細(xì)胞粒細(xì)胞: : 中性粒細(xì)胞-吞噬并殺滅病原微生物；嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞-抵抗寄生蟲，與過敏反應(yīng)有關(guān)。顆粒中含有多種酶和毒顆粒中含有多種酶和毒性蛋白，在細(xì)胞活化時(shí)性蛋白，在細(xì)胞活化時(shí)釋放并殺滅病原體。釋放并殺滅病原體。DCDC細(xì)胞攝取病原體后變?yōu)槌墒斓募?xì)胞攝取病原體后變?yōu)槌墒斓腄CDC細(xì)胞細(xì)胞初

8、始初始T T細(xì)胞細(xì)胞活化的活化的T T細(xì)胞細(xì)胞 DCDC是天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁是天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁 樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞 (DC)(DC)天然免疫獲得性免疫DCDCDC是天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁是天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁 淋巴細(xì)胞:T B NK獲得性免疫天然免疫紅細(xì)胞紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞: :小小, ,無(wú)特征無(wú)特征HE 染色染色 電鏡觀察電鏡觀察無(wú)功能活性無(wú)功能活性-初始淋巴細(xì)胞初始淋巴細(xì)胞 遇到抗原后,成為活化的淋巴細(xì)胞,并進(jìn)一步分化為全功能的淋巴細(xì)胞,即效應(yīng)淋巴細(xì)胞。 B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(B(B細(xì)胞細(xì)胞) T) T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(T

9、(T細(xì)胞細(xì)胞) ) B-B-細(xì)胞受體細(xì)胞受體(BCR)(BCR)抗體抗體- -免疫球蛋白免疫球蛋白膜型免疫球蛋白膜型免疫球蛋白T-T-細(xì)胞受體細(xì)胞受體 (TCR) (TCR) 殺傷殺傷活化活化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)獲得性免疫細(xì)胞獲得性免疫細(xì)胞記憶性T細(xì)胞記憶性B細(xì)胞活化殺傷病毒或胞內(nèi)病原體感染的細(xì)胞-CD8+T細(xì)胞輔助性T細(xì)胞為其它細(xì)胞的活化和功能提供必須的信號(hào)-CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制其它淋巴細(xì)胞的活性并協(xié)助控制免疫應(yīng)答效應(yīng)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)殺傷自然殺傷細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cellsNatural killer cells，NKNK） 形態(tài)比形態(tài)比T T 、B B 細(xì)胞大，胞質(zhì)

10、中有特殊的顆粒，細(xì)胞大，胞質(zhì)中有特殊的顆粒，含有毒性蛋白含有毒性蛋白, ,不需要特異性免疫刺激，即能不需要特異性免疫刺激，即能夠在體外殺傷某些腫瘤細(xì)胞系。夠在體外殺傷某些腫瘤細(xì)胞系。 是天然免疫的重要成員是天然免疫的重要成員, , 在獲得性免疫應(yīng)答在獲得性免疫應(yīng)答之前對(duì)控制病毒感染非常重要；之前對(duì)控制病毒感染非常重要； 在外周血單個(gè)核細(xì)胞中占在外周血單個(gè)核細(xì)胞中占10%-15%10%-15%，淋巴結(jié)和，淋巴結(jié)和組織中較少。組織中較少。不表達(dá)抗原特異性受體，也不形成免疫記憶。NK細(xì)胞是機(jī)體早期抗病毒的重要成員四、抗腫瘤免疫機(jī)制四、抗腫瘤免疫機(jī)制免疫細(xì)胞如何發(fā)揮抗腫瘤作用？ 免疫系統(tǒng)識(shí)別“自我”與

11、“非我” 腫瘤細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原1.1.什么是腫瘤抗原？什么是腫瘤抗原？ 腫瘤特異性抗原 (TSA): 僅在腫瘤細(xì)胞上表達(dá); 腫瘤相關(guān)性抗原 (TAA): 在某些腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，也在某些正常細(xì)胞上表達(dá)。 泛指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中新出現(xiàn)或過度表達(dá)的抗原物質(zhì)。機(jī)體產(chǎn)生腫瘤抗原的可能機(jī)制為： 基因突變； 細(xì)胞癌變過程中使原本不表達(dá)的基因被激活； 抗原合成過程的某些環(huán)節(jié)發(fā)生異常（如糖基化異常導(dǎo)致蛋白質(zhì)特殊降解產(chǎn)物的產(chǎn)生）； 胚胎時(shí)期抗原或分化抗原的異常、異位表達(dá)； 某些基因產(chǎn)物尤其是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的過度表達(dá)； 外源性基因（如病毒基因）的表達(dá)。 1 1感應(yīng)階段：感應(yīng)階段： 1 1）抗原遞呈細(xì)胞（）抗原遞呈

12、細(xì)胞（APCAPC）對(duì)外源性抗原的加工、對(duì)外源性抗原的加工、處理、遞呈處理、遞呈2 2）T T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別2.2.反應(yīng)階段反應(yīng)階段3.3.效應(yīng)階段效應(yīng)階段2. 獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答的基本過程獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答的基本過程APC感應(yīng)階段感應(yīng)階段反應(yīng)階段反應(yīng)階段效應(yīng)階段效應(yīng)階段抗原遞呈細(xì)胞CD8+T 抗原遞呈功能 MHC限制性APCAPCB B細(xì)胞細(xì)胞漿細(xì)胞漿細(xì)胞（產(chǎn)生抗體）（產(chǎn)生抗體）T T細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性T T 細(xì)胞（細(xì)胞（CTLCTL）輔助性輔助性T T細(xì)胞細(xì)胞 (Th)(Th)感染部位感染部位滯留在淋巴組織滯留在淋巴組織中活化中活化B B細(xì)胞細(xì)胞骨髓骨髓產(chǎn)生抗體釋放

13、產(chǎn)生抗體釋放到血液中到血液中效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞 CTL細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可直接殺傷腫瘤細(xì)胞; Th細(xì)胞可以活化免疫系統(tǒng)的其它成分，在控制具有免疫原性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)中起重要的作用。（1 1）CTLCTL殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制靶細(xì)胞CTL循環(huán)凋亡凋亡解離CTL胞外分泌顆粒CTL與靶細(xì)胞結(jié)合CTL細(xì)胞質(zhì)重排(2)體液免疫 體液免疫為B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，B細(xì)胞受抗原刺激后活化、增殖、分化，形成漿細(xì)胞并分泌抗體，由于主要是血清或血漿中的抗體發(fā)揮免疫效應(yīng)，故稱為體液免疫?？贵w的抗腫瘤機(jī)制?A.激活補(bǔ)體系統(tǒng)溶解腫瘤細(xì)胞 跨膜孔道 B.抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC) C.抗體的調(diào)理作用 腫瘤

14、細(xì)胞巨噬細(xì)胞抗體與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原結(jié)合溶酶體被調(diào)理的腫瘤細(xì)胞結(jié)合到M的FcR上，并被M吞噬形成吞噬體吞噬溶酶體形成，殺傷腫瘤細(xì)胞抗體 D.抗體的封閉作用 細(xì)胞惡變后其表面可過表達(dá)某些受體，這些受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。 針對(duì)這些受體的抗體可通過封閉腫瘤細(xì)胞表面的受體阻礙其功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 E.抗體改變腫瘤細(xì)胞的粘附特性 抗體與腫瘤細(xì)胞膜表面的抗原結(jié)合后，可干擾腫瘤細(xì)胞的粘附特性，阻止其克隆形成及與血管內(nèi)皮的粘附，從而有助于控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。 抗腫瘤抗體雖然能夠通過上述幾種方式發(fā)揮作用，但一般認(rèn)為，體液免疫在抗腫瘤免疫中只處于從屬地位。 細(xì)胞免疫在抗

15、腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用3.3.天然免疫應(yīng)答天然免疫應(yīng)答 （1 1）自然殺傷細(xì)胞（）自然殺傷細(xì)胞（NKNK） NK是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，對(duì)于抗腫瘤、抗病毒感染非常重要。 NKNK細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制A.A.釋放毒性顆粒釋放毒性顆粒: : NK細(xì)胞含有毒性酶，穿孔蛋白-穿孔素，穿透細(xì)胞膜并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NK靶細(xì)胞 B.B.細(xì)胞因子介導(dǎo)的腫瘤抑制作用細(xì)胞因子介導(dǎo)的腫瘤抑制作用: : 活化的NK細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子,如IFN-,TNF-/,GM-CSF,IL-12。 干擾素(IFN-)抑制細(xì)胞增生，引起多種腫瘤細(xì)胞凋亡,抗腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，是巨噬細(xì)胞主要的活化因子。C.C.抗體依

16、賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (ADCC) (ADCC)（2 2）巨噬細(xì)胞（）巨噬細(xì)胞（M) 活化的活化的M M 與腫瘤細(xì)與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后通過溶酶胞結(jié)合后通過溶酶體酶等直接殺傷腫體酶等直接殺傷腫瘤細(xì)胞；瘤細(xì)胞； 活化的活化的M M 還可分泌還可分泌TNFTNF、NONO等細(xì)胞毒性因子而間接等細(xì)胞毒性因子而間接殺傷腫瘤細(xì)胞；殺傷腫瘤細(xì)胞；抗原遞呈作用殺傷腫瘤分泌細(xì)胞因子IL-1IL-6TNF- IL-8GM-CSF酶溶菌酶酸性水解酶賴氨酸酶酯酶膠原蛋白酶彈性纖維蛋白酶前列腺素補(bǔ)體成分纖維蛋白結(jié)合蛋白凝血因子其它因子M M 還可通過還可通過ADCCADCC殺傷腫瘤細(xì)胞殺傷

17、腫瘤細(xì)胞巨噬細(xì)胞活化的巨噬細(xì)胞 作為遞呈抗原的作為遞呈抗原的APCAPC，活化，活化T T細(xì)胞；細(xì)胞；抗原T細(xì)胞受體T淋巴細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞（M）抗原肽T淋巴細(xì)胞T細(xì)胞受體MHC-抗原肽復(fù)合物五、過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療五、過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療 過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療（過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療（Adoptive cellular Adoptive cellular immunotherapyimmunotherapy，ACI）是轉(zhuǎn)輸體外培養(yǎng)、修飾的效應(yīng)細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞，治療疾病。 細(xì)胞治療可以被認(rèn)為是利用自體或異體細(xì)胞，替換、修復(fù)或增強(qiáng)受損傷組織的或系統(tǒng)的生物功能的一種策略。 ACI

18、ACI治療腫瘤：治療腫瘤： 具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，清除術(shù)后和化療后的殘留腫瘤細(xì)胞； 預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，根治腫瘤； 毒副作用低，特異性高； 是聯(lián)合治療腫瘤的重要部分。I.I.非特異性免疫細(xì)胞非特異性免疫細(xì)胞 NK NK 細(xì)胞細(xì)胞 巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞 DCs DCs LAKs LAKs CIKs CIKs TLR TLR 激動(dòng)劑刺激免疫細(xì)胞激動(dòng)劑刺激免疫細(xì)胞II.II.抗原特異性抗原特異性 T T 細(xì)胞細(xì)胞 CTL CTL TIL TILACIACI的類型：的類型：I. 非特異性免疫細(xì)胞非特異性免疫細(xì)胞1. NK1. NK細(xì)胞用于過繼轉(zhuǎn)輸細(xì)胞用于過繼轉(zhuǎn)輸Science. 2011,

19、7; 331(6013): 4449.NK細(xì)胞被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞 腫瘤可以發(fā)展多種機(jī)制逃逸腫瘤可以發(fā)展多種機(jī)制逃逸NKNK細(xì)胞的攻擊或者誘導(dǎo)細(xì)胞的攻擊或者誘導(dǎo)NKNK細(xì)胞功能缺陷細(xì)胞功能缺陷 NKNK細(xì)胞在腫瘤患者中功能低下細(xì)胞在腫瘤患者中功能低下J Biomedicine and Biotechnology,2011免疫監(jiān)視功能缺陷免疫抑制System administration細(xì)胞因子細(xì)胞因子 自體自體NK細(xì)胞細(xì)胞( IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, type I IFNs，免疫調(diào)節(jié)藥物，免疫調(diào)節(jié)藥物 )

20、體內(nèi)活化體內(nèi)活化NKNK細(xì)胞治療腫瘤的策略細(xì)胞治療腫瘤的策略 抗體抗體(anti-HER-2 MAb;anti-CD20 MAb;anti-EGFR Mab) InfusionADCCNATURE IMMUNOLOGY 2008, 9(5):486 In 1980 Table 2 Clinical trials using strategies to modulate NK cell functions (continued)Table 2 Clinical trials using strategies to modulate NK cell functions (continued)Rit

21、uximab: anti-CD20; Trastuzumab: anti-HER2; Daclizumab: anti-IL-2Ra Ex vivo自體自體 NK細(xì)胞細(xì)胞單倍體相合的單倍體相合的 NK細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞因子細(xì)胞因子 ( IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, type-1 IFNs， 免疫調(diào)節(jié)藥免疫調(diào)節(jié)藥物物 ) 通過細(xì)胞因子刺激通過細(xì)胞因子刺激, ,腫瘤患者的本身的腫瘤患者的本身的NKNK細(xì)胞難于有效回復(fù)抗腫瘤功能細(xì)胞難于有效回復(fù)抗腫瘤功能 自身免疫細(xì)胞在體外活化自身免疫細(xì)胞在體外活化NKNK細(xì)胞的臨床應(yīng)用細(xì)胞的臨床應(yīng)用 (1) (1) 原代原代NKNK

22、細(xì)胞細(xì)胞 通過免疫磁珠的方法純健康供體NK細(xì)胞, 這些NK細(xì)胞具有正常的細(xì)胞表面標(biāo)志、胞內(nèi)細(xì)胞因子、穿孔素和顆粒酶B。供者患者 過繼轉(zhuǎn)輸原代過繼轉(zhuǎn)輸原代 NK細(xì)胞細(xì)胞 原代原代NK細(xì)胞在體外擴(kuò)增和活化細(xì)胞在體外擴(kuò)增和活化13-21天天, 大大提高轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌患者的臨床反大大提高轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌患者的臨床反應(yīng)。應(yīng)。 NKNK細(xì)胞在外周血中的比例低細(xì)胞在外周血中的比例低 (1015%) (1015%)，不，不能持續(xù)增殖；能持續(xù)增殖； 產(chǎn)生高純度的、大量的自體或異基因活化產(chǎn)生高純度的、大量的自體或異基因活化NKNK細(xì)胞非常難，并費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；細(xì)胞非常難，并費(fèi)時(shí)、費(fèi)力； 每個(gè)患者或者供者的每個(gè)患者或者供

23、者的NKNK的差異性對(duì)臨床常規(guī)的差異性對(duì)臨床常規(guī)治療帶來困難。治療帶來困難。 障礙障礙/困難困難YT, NK-YS, HANK-1, NK-92, NKL, KHYG-1 ，NKG(2) NK(2) NK細(xì)胞系細(xì)胞系 Japan EBV-positive Western countries ChinaNK-92 cells NK-92 cell: CD56brightCD16-高效廣譜抗腫瘤作用，表達(dá)高效廣譜抗腫瘤作用，表達(dá)大量活化型受體；大量活化型受體；高水平表達(dá)與細(xì)胞凋亡途徑高水平表達(dá)與細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)的分子及細(xì)胞毒效應(yīng)分有關(guān)的分子及細(xì)胞毒效應(yīng)分子；子；對(duì)惡性黑色素瘤、前列腺癌、對(duì)惡性黑色

24、素瘤、前列腺癌、乳腺癌、白血病淋巴瘤等都乳腺癌、白血病淋巴瘤等都具有高效的殺傷活性。具有高效的殺傷活性。 NK-92NK-92細(xì)胞容易大量擴(kuò)增，適合標(biāo)準(zhǔn)化培細(xì)胞容易大量擴(kuò)增，適合標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)，已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)，是目前最強(qiáng)的、養(yǎng)，已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)，是目前最強(qiáng)的、適于臨床應(yīng)用的適于臨床應(yīng)用的NKNK細(xì)胞系。細(xì)胞系。大規(guī)模培養(yǎng)臨床應(yīng)用大規(guī)模培養(yǎng)臨床應(yīng)用NKNK細(xì)胞系細(xì)胞系2. 2. 淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞（淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞（LAKLAK） 19801980年年, Rosenberg , Rosenberg 及其同事建立了一種及其同事建立了一種IL-2IL-2刺刺激產(chǎn)生大量的淋巴細(xì)胞的新方法激產(chǎn)生

25、大量的淋巴細(xì)胞的新方法, , 這些淋巴細(xì)胞這些淋巴細(xì)胞可以殺傷新鮮的、沒有培養(yǎng)的、原代轉(zhuǎn)移的腫瘤可以殺傷新鮮的、沒有培養(yǎng)的、原代轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞。 LAK LAK 細(xì)胞是細(xì)胞毒性效應(yīng)淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞毒活細(xì)胞是細(xì)胞毒性效應(yīng)淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞毒活性不受性不受 MHC MHC限制，能夠殺傷原代腫瘤細(xì)胞和限制，能夠殺傷原代腫瘤細(xì)胞和NKNK抵抵抗的腫瘤細(xì)胞系抗的腫瘤細(xì)胞系, , 在功能上與在功能上與NKNK細(xì)胞不同。細(xì)胞不同。 LAKLAK細(xì)胞表現(xiàn)出較好的耐受性，以一定的間細(xì)胞表現(xiàn)出較好的耐受性，以一定的間隔時(shí)間重復(fù)輸注，以保持一定數(shù)量的新鮮隔時(shí)間重復(fù)輸注，以保持一定數(shù)量的新鮮的的LAKLAK細(xì)胞。

26、細(xì)胞。 19841984年年, Rosenberg , Rosenberg 及其同事被及其同事被FDAFDA批準(zhǔn)，批準(zhǔn)，IL-2IL-2和和 LAK LAK 用于治療用于治療2525例腫瘤患者，包括例腫瘤患者，包括腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺癌或結(jié)腸癌。腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺癌或結(jié)腸癌。 LAKLAK細(xì)胞的制備：細(xì)胞的制備： 腫瘤患者的外周血腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（單個(gè)核細(xì)胞（PBMCsPBMCs）在體外在體外擴(kuò)增，擴(kuò)增，IL-2IL-2刺激，培養(yǎng)約刺激，培養(yǎng)約5 5天。天。 培養(yǎng)后的培養(yǎng)后的LAKLAK是異質(zhì)性的，含有是異質(zhì)性的，含有CD3-CD56+, CD3-CD56+, CD3+CD56

27、+ CD3+CD56+ 和和 CD3+CD56- CD3+CD56-細(xì)胞；細(xì)胞； 其中其中 CD3+CD56+ T CD3+CD56+ T和和CD3CD3CD56+NK CD56+NK 細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。殺傷作用。 臨床研究證明臨床研究證明, LAK, LAK細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤如腎細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤如腎細(xì)胞癌和黑色素瘤有一定療效。細(xì)胞癌和黑色素瘤有一定療效。 LAK/IL-2 LAK/IL-2 的主要限制是其毒性：的主要限制是其毒性： 全身應(yīng)用全身應(yīng)用IL-2 IL-2 通常是造成副作用的主要通常是造成副作用的主要原因，包括煩躁原因，包括煩躁, , 發(fā)熱發(fā)熱, , 寒冷寒冷, ,頭

28、痛頭痛, ,惡惡心心, ,嘔吐嘔吐, ,皮疹皮疹, ,水腫，水腫，25%25%患者可以發(fā)生患者可以發(fā)生副反應(yīng)。男性呼吸道窘迫綜合征、肝臟副反應(yīng)。男性呼吸道窘迫綜合征、肝臟毒性和脈管炎有報(bào)道。毒性和脈管炎有報(bào)道。3. 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK） CIK是通過培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，培養(yǎng)第一天在培養(yǎng)基中加入IFN- 1000 u/ml, 24小時(shí)后加入抗CD3抗體 50ng/ml和IL-2 300IU/ml。定期加入IL-2,培養(yǎng)基常規(guī)性換液，培養(yǎng)2128天?；颊吡馨图?xì)胞體外患者自體CIK CIK細(xì)胞中CD3+ CD4+ (37.4%)、CD3+ CD8+ (6

29、4.2%); CD3CD56+ NK 細(xì)胞含量小 ( 2%)，培養(yǎng)14天時(shí)，37.7% 為CD3+CD8+CD56+的 自然殺傷自然殺傷T T (NKT)(NKT)細(xì)胞，是細(xì)胞，是CIKCIK中最強(qiáng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞。中最強(qiáng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞。與與LAKLAK細(xì)胞相比，細(xì)胞相比，CIKCIK細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞毒活性細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞毒活性更強(qiáng)；更強(qiáng)；CIK細(xì)胞在識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞時(shí)是非MHC限制性的。 CIKCIK的第一例臨床試驗(yàn)是在的第一例臨床試驗(yàn)是在 1999 1999年，由年，由Schmidt-WolfSchmidt-Wolf等在德國(guó)進(jìn)行，自體等在德國(guó)進(jìn)行，自體CIKCIK細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)入胞轉(zhuǎn)入IL

30、-2 IL-2 基因，轉(zhuǎn)述給基因，轉(zhuǎn)述給1010例腫瘤患者，例腫瘤患者，包括轉(zhuǎn)移性腎癌、結(jié)腸癌和淋巴瘤。其中，包括轉(zhuǎn)移性腎癌、結(jié)腸癌和淋巴瘤。其中，1 1例患濾泡性淋巴瘤者完全緩解。除了例患濾泡性淋巴瘤者完全緩解。除了 3 3例患者有發(fā)熱的癥狀外，沒有嚴(yán)重的副反例患者有發(fā)熱的癥狀外，沒有嚴(yán)重的副反應(yīng)。應(yīng)。 一項(xiàng)來自中國(guó)的報(bào)道，用一項(xiàng)來自中國(guó)的報(bào)道，用CIKCIK輔助治療急性白血病輔助治療急性白血病, , 1919例接受例接受1414個(gè)療程自體個(gè)療程自體CIKCIK細(xì)胞輸注聯(lián)合化療的細(xì)胞輸注聯(lián)合化療的患者中患者中,73.4%,73.4%在隨后的在隨后的4 4年中維持持續(xù)緩解年中維持持續(xù)緩解, ,

31、只作只作化療的患者僅為化療的患者僅為27.3%27.3%。 作為免疫治療方式作為免疫治療方式, CIK, CIK治療腫瘤量較小的患者有治療腫瘤量較小的患者有效或者作為輔助治療效或者作為輔助治療, , 不適合用于治療腫瘤量較不適合用于治療腫瘤量較大的患者。大的患者。 CIK的機(jī)制: 釋放炎癥因子, 如IFN, TNF, 穿孔素, 顆粒酶B殺傷腫瘤細(xì)胞; 通過 Fas-Fas L 途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 CIK 已經(jīng)成功用于臨床治療胃癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、白血病等。 II.抗原特異性抗原特異性 T 細(xì)胞細(xì)胞 T T細(xì)胞在抗腫瘤的免疫應(yīng)答中細(xì)胞免細(xì)胞在抗腫瘤的免疫應(yīng)答中細(xì)胞免疫起著主要作用，特別是疫起

32、著主要作用，特別是CTLCTL，它是，它是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，故也應(yīng)抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，故也應(yīng)是用于過繼免疫治療的最佳細(xì)胞。是用于過繼免疫治療的最佳細(xì)胞。 T細(xì)胞活化抗原遞呈細(xì)胞腫瘤細(xì)胞腫瘤抗原腫瘤抗原表達(dá)識(shí)別與殺傷腫瘤細(xì)胞抗原的識(shí)別與遞呈淋巴結(jié)淋巴結(jié)CD8+T 細(xì)胞CD8+T 細(xì)胞血液循環(huán)血液循環(huán)腫瘤血管腫瘤血管遷移遷移 Flood發(fā)現(xiàn)CTL在體內(nèi)聚集到腫瘤部位的能力強(qiáng)于LAK和NK，且能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤疫苗在體內(nèi)應(yīng)用可增加體內(nèi)的腫瘤特異性CTL的數(shù)量，但到一定水平時(shí)候，體內(nèi)的CTL到達(dá)平穩(wěn)期而不再增加，這主要是由于體內(nèi)存在的特異性及非特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)限制

33、了CTL的擴(kuò)增。 所以，利用細(xì)胞因子或免疫刺激劑直接活化腫瘤患者體內(nèi)CTL受到限制。 在體外培養(yǎng)可突破此調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，大量擴(kuò)增免疫效應(yīng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)輸抗原特異性轉(zhuǎn)輸抗原特異性T T細(xì)胞細(xì)胞 因?yàn)槟[瘤相關(guān)抗原TAA是“自身”抗原，免疫系統(tǒng)難于識(shí)別； 腫瘤患者體內(nèi)難于產(chǎn)生對(duì)腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞, 甚至在體外最佳條件下也難于大規(guī)模培養(yǎng)。 4. 腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞 (TIL) 19861986年年, Rosenberg , Rosenberg 及其同事應(yīng)用及其同事應(yīng)用TILTIL在小在小鼠模型中證明鼠模型中證明, , 聯(lián)合自體聯(lián)合自體TILTIL和環(huán)磷酰胺可和環(huán)磷酰胺可以緩解腫瘤轉(zhuǎn)移。以緩解腫瘤轉(zhuǎn)

34、移。 之后很快在之后很快在 1988 1988年首次報(bào)道了利用年首次報(bào)道了利用TIL TIL 治治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤能夠誘導(dǎo)腫瘤緩解。療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤能夠誘導(dǎo)腫瘤緩解。如何制備如何制備TIL?TIL?大約需要大約需要 56 56 周周TILTIL增殖增殖: :粘附粘附的腫瘤細(xì)胞死的腫瘤細(xì)胞死亡或被淋巴細(xì)亡或被淋巴細(xì)胞殺死而消失胞殺死而消失生長(zhǎng)生長(zhǎng)24 24 周周鑒定鑒定TIL TIL 殺傷殺傷腫瘤的活性腫瘤的活性直徑大于直徑大于2cm2cm的的活檢腫瘤組織，活檢腫瘤組織，剪碎，培養(yǎng)基中剪碎，培養(yǎng)基中快速擴(kuò)增快速擴(kuò)增: : 抗抗CD3 CD3 抗體抗體, , IL-2 IL-2 和滅活的同種異體和

35、滅活的同種異體PBMCsPBMCs飼養(yǎng)細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞，2 2周周轉(zhuǎn)輸患者挑選應(yīng)答最強(qiáng)的挑選應(yīng)答最強(qiáng)的細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆維持 TIL的存活，誘導(dǎo)腫瘤消失清除淋巴細(xì)胞，減少與 TIL競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞因子,如IL-7和IL-15; 清除內(nèi)源性Treg. 六、六、TLRTLR配體激活的免疫效應(yīng)細(xì)配體激活的免疫效應(yīng)細(xì) 什么是什么是TLRTLR？ Toll-like receptor，Toll樣受體。 是一類模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別微生物的特異性成分和某些宿主分子，構(gòu)成防御很多病原體的第一道防線，在天然免疫系統(tǒng)中起著決定性的作用。此外，TLR連接天然免疫與獲得性免疫。已經(jīng)鑒定的人TLRs有11種細(xì)胞膜內(nèi)體內(nèi)體 TLR

36、1廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、NK細(xì)胞； TLR2/4/5主要分布于除T、B、NK細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞； TLR3主要表達(dá)于未成熟的DC等； TLR7-TLR9主要表達(dá)于單核細(xì)胞、DC細(xì)胞核巨噬細(xì)胞。TLRs與腫瘤免疫治療 腫瘤免疫逃逸的策略腫瘤免疫逃逸的策略12345免疫抑制分子招募Treg共刺激分子缺失促凋亡分子 通過活化TLRs激活免疫系統(tǒng)，打破腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤作用。 作為腫瘤生物治療的關(guān)鍵問題是打破腫瘤導(dǎo)致的免疫耐受狀態(tài)！TLRTLR配體已經(jīng)通過多種途徑應(yīng)用配體已經(jīng)通過多種途徑應(yīng)用外用乳膏外用乳膏 靜脈注射靜脈注射 口服口服 瘤內(nèi)注射瘤內(nèi)

37、注射 皮下注射皮下注射 TLR3,4,7/8和TLR9激動(dòng)劑被列入美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）免疫治療腫瘤藥物，具有強(qiáng)大的抗腫瘤潛力。1.TLR-7激動(dòng)劑(1)天然ssRNA及其衍生物: 通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，然后與TLR-7相互作用。 TLR7ssRNA：?jiǎn)捂淩NADCDC產(chǎn)生產(chǎn)生IL-12IL-12和和I I型型IFNIFN活化活化NKNK細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-IFN- 并增強(qiáng)并增強(qiáng)細(xì)胞毒作用細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)TLR-7 TLR-7 激動(dòng)劑激動(dòng)劑ssRNAssRNA機(jī)制機(jī)制: :(2)合成的TLR7激動(dòng)劑Imiquimod (咪喹莫特):HPV

38、-相關(guān)的皮膚惡性腫瘤 (淺表性基底細(xì)胞癌淺表性基底細(xì)胞癌 sBCC), III期臨床研究表明組織學(xué)清除率為7982%；癌變前的光線性角化病治療。外用乳膏外用乳膏 機(jī)制機(jī)制: : 誘導(dǎo)細(xì)胞因子如 IFN-和 IL-12產(chǎn)生; 增強(qiáng)腫瘤特異性CTLs的活化； 活化具有殺傷活性的mDC亞群的活化。 有20項(xiàng)臨床試驗(yàn)在進(jìn)行, Imiquimod有做疫苗佐劑的臨床試驗(yàn)有10項(xiàng)。 PolyI:C PolyI:C( (多聚肌苷酸多聚肌苷酸- -胞苷酸胞苷酸), ), 合成的病毒合成的病毒dsRNAdsRNA類似物類似物 誘導(dǎo)誘導(dǎo) I I型型 IFNs IFNs的產(chǎn)生的產(chǎn)生 分子式分子式: : (C10H13N4O8P)x.(C9H14N3O8P)x(C10H13N4O8P)x.(C9H14N3O8P)x2.TLR32.TLR3激動(dòng)劑激動(dòng)劑dsRNAdsRNA：雙鏈：雙鏈RNARNA 成熟DC, 其活化抗原特異性T細(xì)胞的能力增強(qiáng), CD4+ T細(xì)胞向Th1方向分化，分泌大量IFN。Ovarian cancer patients 在人類, TLR9 主要表達(dá)于B細(xì)胞和pDCs CpG ODNs（人工合成的非甲基化雙鏈寡核苷酸），分為三種類型: