1、 基因重組和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering目 錄2第 一 節(jié)DNA的重組 DNA RecombinationDNA重組轉 座 (transposition)同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組(site-specific recombination)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。 以E.coli的同源重組為例，了解同

2、源重組機制的Holliday模型。一、同源重組Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟 兩個同源染色體DNA排列整齊一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體通過分支移動產生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patch recombinant)拼接重組體(splice recombinant) 片段重組體 （見模型圖右邊產物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的

3、兩側來自不同親本DNA。 內切酶 (recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移 (recA) 內切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中間體53535353目 錄Holiday中間體535353535355533355553333555533335555333355553333內切酶(ruvC)內切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶拼接重組體片段重組體目 錄二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DN

4、A轉移稱為接合作用(conjugation)?？山雍腺|粒如 F 因子(F factor) 質粒 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用 (transformation)。 例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。目 錄（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysis pathway)溶源菌生長途徑(lysogenic pathway

5、)例目 錄目 錄三、位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。例 （一）噬菌體DNA的整合噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)。 例（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變 hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達

6、，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側均存在保守的重組信號序列(recombi

7、nation signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個，分別產生蛋白質RAG1和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列基因片段V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應單鏈切開轉移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程目 錄四、轉座重組由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。插入序列(insertion sequences, IS)組成：二個分離的反

8、向重復(inverted repeats, IR)序列特有的正向重復序列 一個轉座酶（transposase)編碼基因 IRTransposase GeneIR發(fā)生形式：保守性轉座(conservative transposition)復制性轉座(duplicative transposition)（一）插入序列轉座插入序列的復制性轉座目 錄轉座子(transposons) 可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。 轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基因（二）轉座子轉座由轉座子介導的轉座目 錄第 二 節(jié) 重組DNA技

9、術DNA Recombination Technique 重組DNA技術的發(fā)展史年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年 美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年 開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉相關概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理 重組DNA技術與醫(yī)學的關系本節(jié)主要內容一、重組DNA技術相關概念 克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝

10、的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆技術水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮〥NA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等目的 分離獲

11、得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。（二）工具酶 限制性核酸內切酶 DNA聚合酶 逆轉錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉移酶 Taq DNA聚合酶重組DNA技術中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3末端Klenow片

12、段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內切酶定義限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾

13、系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護自身DNA。分類、（基因工程技術中常用型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶類酶識別序列特點 回文結構(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些

14、酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同類型的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因組DNA (genomic DNA)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋

15、白質所采用的一些DNA分子。常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。1. 質粒 (plasmid)特點 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 二、重組DNA技

16、術基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達 以 質 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程目 錄（一）目的基因的獲取1. 化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列 。2.基因組DNA文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) （見第22章） * 化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌

17、限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合* 從基因組DNA文庫獲取目的基因目 錄限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫目 錄mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉錄酶 載體 受體菌 復制* 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶

18、DNA聚合酶堿水解 T T T T目 錄（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建Bam H切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目 錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接Eco R切割位點Bg l切割位點+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目

19、 錄2. 平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連目 錄3. 同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5335載體DNA5335目的基因限制酶或機械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體目 錄4. 人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。 人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目 錄受體菌條件安全宿主菌 處于感受態(tài)(competent) 導入方式轉化 (