1、六神丸血漿藥物化學(xué)的研究六神丸是一種擁有100多年歷史，享譽國內(nèi)外的著名中成藥。六神丸由六味藥材配置而成，包括牛黃、珍珠、蟾酥、明雄黃、麝香、冰片。其具有清熱解毒、消腫止痛的作用1，2，應(yīng)用于咽喉腫痛、癰瘍疔瘡等?，F(xiàn)代中藥開發(fā)中，將六神丸應(yīng)用于更多疾病，如消炎、鎮(zhèn)痛、抗肝癌、抗腫瘤等36。對于六神丸成分的分析，曹陽等有相關(guān)報道79。本文基于對六神丸HPL圖譜的分析，旨在建立六神丸血漿藥物化學(xué)的研究方法，從而為探究六神丸有效成分及其作用機制奠定基矗目前對于中藥復(fù)方六神丸的有效成分研究過于分散而缺乏系統(tǒng)性，仍不能明確有效的物質(zhì)基矗中藥血漿藥物化學(xué)以中藥口服后含藥血漿為對象，綜合應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù)，分

2、析鑒定含藥血漿中的移行成分，包括中藥原型成分及其代謝產(chǎn)物，以研究中藥在體內(nèi)發(fā)揮作用物質(zhì)11。藥物無論經(jīng)過何種代謝必須由給藥部位進入血液循環(huán)，以血液為介質(zhì)輸出到靶點，從而產(chǎn)生作用，中藥亦是如此。藥物進入血液可能是其原形化合物，也可能是其代謝產(chǎn)物，還有可能是機體應(yīng)激產(chǎn)生的活性物質(zhì)發(fā)揮藥效1215。本實驗通過比照分析空白血漿、體內(nèi)六神丸血漿、體外六神丸血漿、體內(nèi)標準品血漿以及體外標準品血漿的HPL-UV圖譜，研究六神丸進入血液后的原形藥物及其代謝成分的變化狀況。以此逆向追溯六神丸藥效活性物質(zhì)群，有助于建立六神丸基于生物效應(yīng)的品質(zhì)評價指標。2材料與試劑2.1儀器儀器選用分析型高效液相色譜儀Ultiat

3、e3000Pup、Ultiate3000Autsapler、Ultiate3000lunpartent、Ultiate3000DideArrayDetetr2.2試劑試劑包括：六神丸上海雷允上藥業(yè)，批號：140701，5-羥色胺鹽酸中國食品藥品鑒定研究院，批號：111656，華蟾毒它靈上海源葉生物科技，批號：p24N7F25514，蟾毒它靈上海源葉生物科技，批號：p127F22619，蟾毒靈上海源葉生物科技，批號：05D6Z7090，華蟾酥毒基上海源葉生物科技，批號：107Z22424，酯蟾毒配基上海源葉生物科技，批號：PJ0727RB13。乙腈為色譜純，乙酸乙酯國藥AR，其他試劑均為分析純。

4、2.3動物3方法3.1六神丸灌胃藥液及標準品灌胃藥液的制備將六神丸研磨成粉，稱取一定量六神丸粉末，配制成8.0g/L的水溶藥液，超聲30in，使其充分溶解，于4冰箱保存，備用。將華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈配制成1g/L的水溶液，超聲30in，使其充分溶解，于4冰箱保存，備用。3.2體內(nèi)六神丸血漿樣品和空白血漿樣品的制備空白血漿的制備：安康SD大鼠4只，禁食12h，灌胃生理鹽水，在1h后，將每只大鼠摘眼球取血，各5L以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)，備用。體內(nèi)六神丸血漿樣品制備：安康SD大鼠3只，禁食12h，灌胃六神丸水溶液36.0g/kg約1L，給藥1h后，每只大鼠

5、摘眼球取血5L以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)，制備3份樣品備用。取以上制備的樣品各5L，參加25L乙酸乙酯，漩渦混懸30s，3000r/in離心5in，取上清液；將沉淀再加25L乙酸乙酯，旋窩混懸30s，3000r/in離心5in，取上清液。合并兩次上清，揮干溶劑，在進樣前參加300L甲醇，使充分溶解后，用0.45的濾頭過濾備用。3.3體外六神丸血漿樣品的處理為減小藥物與血液樣品處理方法不同所帶來的誤差，取3.1節(jié)條件下制備的六神丸灌胃液1L和5L空白血漿混合，漩渦混懸30s，靜置1h，按照血漿樣品處理方法進展預(yù)處理，平行制備3份樣品備用。3.4不同時間點含藥血漿樣品的處理安康SD大鼠15

6、只，禁食12h，分成0.5、1、3、6、24h五組，每組三只大鼠，每組大鼠灌胃六神丸水溶液36g/kg一次，約1L，在給藥后0.5、1、3、6、24h的時間點，每組大鼠摘眼球取血5L以上，本文由論文聯(lián)盟.Ll.搜集整理置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)。每份樣品取血漿5L，加25L乙酸乙酯，漩渦混懸30s，3000r/in離心5in，取上清液；將沉淀再加25L乙酸乙酯，旋窩混懸30s，3000r/in離心5in，取上清液。合并兩次上清，揮干溶劑，在進樣前參加300L甲醇，使充分溶解后，用0.45的濾頭過濾，制備得到15份樣品，備用。3.5體內(nèi)標準品血漿樣品的處理安康SD大鼠15只，禁食12h，分成華

7、蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈五組，每組3只，將3.1節(jié)條件下制備的標準品溶液給每組大鼠灌胃5.0g/kg約1L，每組給藥1h后，每只大鼠摘眼球取血5L以上，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管內(nèi)。每份樣品取血漿5L，加25L乙酸乙酯，漩渦混懸30s，3000r/in，離心5in取上清液；將沉淀再加25L乙酸乙酯，旋窩混懸30s，3000r/in，離心5in取上清液。合并兩次上清，揮干溶劑，進樣前參加300L甲醇，使其充分溶解，0.45濾頭過濾，制備15份樣品以備用。3.6體外標準品血漿樣品的處理為減小藥物與血液樣品處理方法不同所帶來的誤差，取3.1節(jié)條件下制備的5種標準品樣品各1L

8、，分別與5L空白血漿混合，漩渦混懸30s，靜置1h，按照血漿樣品處理方法進展預(yù)處理。每種標準品平行制備3組備用。3.7高效液相色譜條件DINEXultiate3000高效液相色譜儀；DINEX18色譜柱2504.6，5，流動相為乙腈A和0.1%三氟乙酸水溶液B。梯度洗脫，03in，5%A；313in，5%12%A；1315in，12%20%A；1525in，20%30%A；2530in，30%51%A；3050in，51%A；5060in，5%A。體積流量1.0L/in，進樣量10L，檢測波長296n，柱溫30。張妹砣，等：六神丸血漿藥物化學(xué)的研究生物與化工4結(jié)果與分析4.1六神丸入血后移行成

9、分的分析將空白血漿樣品、體內(nèi)六神丸血漿樣品和體外六神丸樣品在2.7色譜條件下進樣，進樣量為10L。相對空白血漿樣品的HPL圖，體內(nèi)六神丸血漿樣品的HPL圖中出現(xiàn)了14個移行成分，如圖1。與體外六神丸樣品比擬，其中10、11、12、13、14號等五個成分保存時間與原型成分一樣，可能為六神丸中所含的原型成分直接吸收入血。其中11號和12號移行成分相對其他成分含量顯著較高，而體外六神丸血漿樣品中所含的大局部原型成分在體內(nèi)已明顯下降甚至消失。其它9個成分為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可能是六神丸中其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化消費，也可能是體內(nèi)應(yīng)激反響產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。六神丸灌胃后入血的14種成分為六神丸在體內(nèi)直接作用物質(zhì)，研究其

10、變化規(guī)律將有利于進一步探究其活性成分和作用機理。4.2六神丸入血后成分含量變化的檢測在3.4節(jié)條件下，制備不同時間點的體內(nèi)六神丸血漿樣品，在3.7節(jié)條件下進樣，進樣量為10L。如圖2-A所示，有局部代謝產(chǎn)物如10、11、12、14號移行成分含量逐漸增加，其中11號和12號移行成分隨著時間延長，濃度顯著增加，呈現(xiàn)濃度-時間依賴關(guān)系。以峰面積為縱坐標，時間為橫坐標，建立關(guān)系曲線，如圖2-B所示，可發(fā)現(xiàn)12號移行成分的濃度在6h累計到達最大值，之后隨著時間延長呈緩慢降低趨勢。11號移行成分的濃度隨著時間延長不斷增加。另一方面，隨著時間延長，有的代謝產(chǎn)物逐漸減少如13號移行成分，有些甚至消失如5、6、

11、9號三個移行成分。在24h時，還產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物15號成分。值得注意的是，增加的10、11、12、14號移行成分與六神丸中主要原型成分的保存時間非常相近，可能為原型產(chǎn)成分。而減少的5、6、9號物質(zhì)應(yīng)為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。由此可知，六神丸灌胃后，有的以原型入血，且不斷通過其他成分轉(zhuǎn)化或體內(nèi)應(yīng)激反響生成，使得含量不斷增加。局部轉(zhuǎn)化為新的代謝產(chǎn)物，由于缺少來源，逐漸減少甚至消失。而15號峰可能為體內(nèi)應(yīng)激反響產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。由此可見，六神丸的藥效關(guān)系是復(fù)雜多變的，不是單成分代謝反響的疊加，而是受機體吸收、代謝及成分間互相作用的綜合影響，使得中藥復(fù)方六神丸比單味藥、單體用藥效果更顯著。4.3標準品入血后移

12、行成分的分析在3.5節(jié)條件下制備的體內(nèi)標準品血漿樣品，在3.6節(jié)條件下制備的體外標準品血漿樣品，在3.7節(jié)的條件下進樣分析，進樣量為10L。如圖3所示，比照標準品在體外、體內(nèi)的成分變化，發(fā)現(xiàn)六神丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈在體內(nèi)代謝后進入血漿的成分，主要為10、11、12、13號移行成分，主要轉(zhuǎn)化為12號移行成分。將12號移行成分的峰面積與體外標準品的峰面積相比，推測華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈轉(zhuǎn)化成12號移行成分的轉(zhuǎn)化率為：7.48%、2.93%、0.55%、0.94%。由此可見，華蟾酥毒基轉(zhuǎn)化率相對最高，酯蟾毒配基的轉(zhuǎn)化率次之，蟾毒靈的轉(zhuǎn)化率最低，同

13、時，華蟾酥毒基在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為10、11號物質(zhì)對應(yīng)的峰面積也是最高的。這與六神丸體內(nèi)代謝的移行成分的分析相契合，說明六神丸中的大局部成分在體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為12號類物質(zhì)，發(fā)揮有效或制毒作用。在本實驗室之前的工作中，發(fā)現(xiàn)六神丸醇提物對抗肝癌活性較六神丸水提物強2，對六神丸的各成分含量分析發(fā)現(xiàn)，在其他成分含量相當?shù)那疤嵯?，六神丸醇提物中的華蟾酥毒基與酯蟾毒配基的含量是六神丸水提物的四倍，這與血漿中華蟾酥毒基與酯蟾毒配基的代謝分析相契合。推測華蟾酥毒基、酯蟾毒配基以及代謝生成的12號移行成分，可能是六神丸發(fā)揮作用的有效物質(zhì)。2022年6月綠色科技第12期5結(jié)語六神丸是傳統(tǒng)中藥名方，對其藥物代謝研究得較少，對

14、體內(nèi)血漿藥物化學(xué)鮮有報道。在血漿樣品的制備中，比照了甲醇、乙腈、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷提取血漿中六神丸成分的效果，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取效果最正確且穩(wěn)定，對樣品也不造成的干擾。每組制備的三份平行樣品，一樣條件下進樣分析所得HPL圖譜相似，以其中最大峰為指標，測定峰面積的RSD值均小于5.32，說明本系統(tǒng)的方法穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性。本文首次建立了體內(nèi)六神丸血漿成分的HPL圖，并實現(xiàn)所有成分的有效別離，與體外六神丸的HPL圖進展比照分析，探究六神丸進入體內(nèi)的成分代謝變化，利用標準品體內(nèi)、體外的HPL圖比照，發(fā)現(xiàn)其都向12號物質(zhì)移行，這體內(nèi)六神丸血漿樣品的主要成分分析相契合。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，局部提醒了六神丸入血后移行成分變化規(guī)律，為之后六神丸有效成分研究奠定根底，也為六神丸的再開發(fā)提供參考與借鑒。該研究結(jié)果也說明，要確定中藥