1、Notice1.上課請關(guān)手機(jī)（或調(diào)成振動，接電話到室外）。2. 選修課自愿選擇，試聽一次，下次課班長提交選修課學(xué)生名單(包括email)。3. 學(xué)分問題 平時表現(xiàn) 如：紀(jì)律、問答、作業(yè)。 結(jié)課測驗? 對本課程的意見和建議；組織病理學(xué)制片技術(shù)Histopathologic technology生命科學(xué)研究中心 邢立強(qiáng)2目的和要求Aims and Requirements了解生物組織的特點及取材的注意事項；熟悉切片的原理、一般要求及注意事項；掌握石蠟切片制作技術(shù)；病理學(xué)常用的觀察手段The common survey means in pathology1、大體標(biāo)本觀察：主要用肉眼、量尺及各種衡器

2、等輔助工具，對所檢標(biāo)本的大小、形狀、色澤、重量、表面及切面、病灶特點進(jìn)行觀察及測量。2、組織切片的觀察：取正常或病變組織進(jìn)行切片、染色(HE染色最常用)在顯微鏡下進(jìn)行觀察。病理學(xué)標(biāo)本的種類Types of pathologic samples 1、活體組織檢查(Biopsy)：簡稱活檢，從患者活體局部切取、鉗咬、細(xì)針吸取和摘取等手術(shù)方法獲取病變組織進(jìn)行病理檢查。2、脫落細(xì)胞學(xué)檢查(Exfoliative cytological exam)：對患者痰液、胸腹水、尿液以及陰道刮片、食管拉網(wǎng)、纖維胃/支氣管鏡所取得的材料進(jìn)行涂片，以檢查脫落細(xì)胞，是早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤的好方法。3、尸體解剖(Autop

3、sy)：通過尸檢可查出病因和病變，及時發(fā)現(xiàn)和確診某些傳染病、新發(fā)現(xiàn)的疾病，積累經(jīng)驗，提高診療水平。4、動物實驗(Animal experiment)：根據(jù)研究需要，在動物身上復(fù)制人類某些疾病的模型、進(jìn)行觀察研究，了解疾病的病因、發(fā)病機(jī)制及藥物療效等。5、組織/細(xì)胞培養(yǎng)(Tissue and Cell culture)：將某種組織或單細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，來研究各種病因作用下組織、細(xì)胞的病理變化及治療效果。病理技術(shù)的應(yīng)用Application of pathologic technique幫助臨床查明死因(尸檢);手術(shù)后病變標(biāo)本，明確診斷(臨床活檢);為教學(xué)、科研提供資料;取材(Samp

4、le collection)固定(Fixation)脫水(Dehydration)透明(Transparentizing) 浸蠟(Paraffin soaking)包埋(Embedding)第一節(jié) 組織處理Tissue processing 1. 人為因素 2. 標(biāo)本大小 3. 取材時間 4. 包埋方向 5. 邊緣標(biāo)記一、取材(Samples collection) 6. 小標(biāo)本的處理方法 7. 特殊情況取材 8. 取材數(shù)量 9. 清除多余成分 10. 重復(fù)取材 11. 核對取材12. 剩余組織存放 二、固定(Fixation)固定就是用物理或化學(xué)方法，阻止組織細(xì)胞離體或培養(yǎng)細(xì)胞脫離生存環(huán)境后

5、發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。(一)固定的目的1. 迅速阻斷組織細(xì)胞離體后的自溶性變化，防止腐敗，盡量保持組織細(xì)胞生活狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2. 使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，并保持原有的空間位置。3. 固定劑有硬化作用,增加組織的硬度,便于制片。4. 組織中的各種物質(zhì)經(jīng)固定后產(chǎn)生對染料的親和力，利于染色和觀察。（二）常用的固定方法1. 浸泡固定法 2. 灌注固定法 3. 細(xì)胞涂片的固定方法4. 微波固定法5. 蒸氣固定法（三）常用的固定液1. 單純固定液(1) 甲醛(formaldehyde)(2) 酒精(alcohol)(3) 苦味酸(picric acid) (4) 丙酮(acet

6、one)(5) 醋酸(acetic acid) 2. 混合固定液(1) Bouin液 ：用于結(jié)締組織及脂肪染色；(2) Zenker液：常用于三色染色； (3) 4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉-氫氧化鈉液； （四）固定后的處理1. 一般固定液(甲醛等)固定組織后，用流水沖洗以清除組 織內(nèi)的固定液終止固定。2. 含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，組織固定后不需要或不能用水沖洗。3. 含有鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸的固定液，組織固定后應(yīng)充分水洗，一般為1224h。4. 用含汞的固定液固定組織后，要進(jìn)行脫汞處理，可在組織脫水前或切片染色前進(jìn)行，一般多在染色前脫汞。其方法為切片脫蠟入水后，入0.5%碘乙醇510mi

7、n，水洗后再入3%5%硫代硫酸鈉或95%乙醇12min，再充分水洗，蒸餾水洗后進(jìn)行染色。（五）固定時的注意事項1. 標(biāo)本 應(yīng)新鮮并及時取材，快速放入固定液中。特殊標(biāo)本應(yīng)單獨固定和存放。2. 固定液的用量 一般固定液用量為組織塊體積的1020倍，貴重的固定液不少于35倍。避免組織緊貼容器底部，影響固定效果。對于特殊染色的組織(如神經(jīng)染色及酶組織化學(xué)染色等)固定時應(yīng)考慮組織塊的大小、固定液種類、固定時間和溫度等。酶組織化學(xué)染色組織的固定應(yīng)置于冰箱4固定。3. 防止組織變形 柔軟或較薄的組織先平鋪在吸水紙上，再投入固定劑中；含氣或脂肪多的組織易浮于液面，可在組織表面覆蓋棉花以達(dá)到充分固定。4. 固定

8、液的穿透性 一般固定液在24h內(nèi)不能穿透厚度大于23mm的實體組織或5mm的多孔疏松組織，故取材組織塊的厚度原則上不應(yīng)超過34mm。5. 固定時間 固定的時間與固定液的種類、組織類型、塊大小、溫度等有關(guān)。一般1.5cm1.5cm0.2 0.3cm大小的組織塊, 固定時間為1224h。6. 固定溫度 大多數(shù)可在室溫(25)固定，在低溫(如4)固定時，固定時間要相應(yīng)延長。三、脫水(Dehydration)組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，水與石蠟不能混溶。因此在浸蠟和包埋前，必須進(jìn)行脫水。 常見的脫水劑有乙醇、正丁醇、丙酮等。為防止水份丟失過快，造成組織變形，一般采用梯度脫水法。也就是使脫水劑的濃度逐

9、漸升高，脫水過程盡量緩和，減少組織變形。 四、透明(Transparentizing)常用的透明劑有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、環(huán)己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。目前也有用環(huán)己酮作為透明劑，環(huán)己酮為無色無毒液體，可與苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蠟。而且脫水時組織不收縮變硬，用于快速石蠟切片效果較好。 五、浸蠟(Paraffin wax soaking)用熔化的切片石蠟逐漸替換組織中二甲苯的過程。六、組織的包埋和包埋方法(Embedding)（一）常規(guī)石蠟包埋 （二）脫落細(xì)胞標(biāo)本的包埋 （三）微小標(biāo)本的包埋 第二節(jié) 組織切片法(Tissue sectioning)組織切片法包括石

10、蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機(jī)、切片刀和自動磨刀機(jī)等。 一、組織切片機(jī)和切片刀1. 石蠟切片機(jī) 2. 火棉膠切片機(jī) 3. 恒冷箱切片機(jī) 4. 震動切片機(jī) 石蠟切片機(jī)震動切片機(jī)恒冷箱切片機(jī)切片刀切片刀是切片機(jī)的重要部件，常見的有兩種： 一種為可重復(fù)使用的鋼刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、2024cm等，根據(jù)切片刀的形態(tài)，有平凹型、深平凹型、平楔型、雙凹型。 另一種為一次性鋼刀片，是一種薄型切片刀片，用于普通石蠟切片。使用時固定在特制的刀架上。各種切片刀的剖面圖a平凹形 b深平凹形 c平楔形 d雙凹形石蠟切片機(jī)用

11、一次性鋼刀片二、組織切片(Tissue sectioning)石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。 (一)切片前的準(zhǔn)備1. 備齊常用器具, 如玻片、毛筆和鉛筆或刻字筆。2. 檢查切片機(jī)的工作狀態(tài), 將固件都擰緊，檢查切片刀是否鋒利, 切片刀質(zhì)量是保證切片的關(guān)鍵。如果使用一次性刀片, 應(yīng)根據(jù)切片情況及時調(diào)整刀刃位置。3. 清潔玻片的方法（1）新載玻片的處理： 先用清潔液浸泡1224h, 流水充分沖洗后, 用蒸餾水洗35遍, 95%酒精浸泡2h, 用綢布擦干或用烘箱烤干備用。清潔液是用重鉻酸鉀和濃硫酸按比例配成的洗液。常用的有以下幾種配方：重鉻酸鉀(g):濃硫酸(ml):蒸

12、餾水(ml)=1:1:10;重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:3:25;重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:5:15。 （2）蓋玻片的處理：蓋玻片可按以上方法處理，但因蓋玻片很薄，以上處理程序應(yīng)縮短。清潔液浸泡2h，流水沖洗。也可用以下方法清洗:蓋玻片立排于臥式染缸(排2行，中間隔以載玻片)。松緊度以玻片可輕松轉(zhuǎn)動為好，以下步驟應(yīng)保持液體進(jìn)入每個玻片間隙，玻片之間不能有氣泡。用1%鹽酸酒精浸泡2h，然后流水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗數(shù)次。入95%酒精浸泡23h，無水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60烘箱烤干備用。 （二）切片制作過程1. 蠟塊在冰箱中預(yù)冷，然后固定在切片機(jī)上。將切片刀裝在刀架上。調(diào)整蠟塊與

13、刀的位置，使蠟塊切面與刀刃接近。2.切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，使用時左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪。先修出標(biāo)本，直到組織全部暴露于切面為止，標(biāo)本過小時修塊應(yīng)多加注意，大標(biāo)本要切全。切出蠟帶后，用毛筆輕輕挑起一端，用鑷子夾起另一端，正面向上放入展片水槽中(水溫一般低于蠟熔點1012)，待切片展平后，即可進(jìn)行撈片。3. 切片時刀是由下向上運動，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的部分放在上端(如皮膚組織的表皮部分，胃腸等組織的漿膜面等)。4. 撈片時注意組織片的擺放位置，盡量整齊美觀。要留出貼標(biāo)簽的空間，5. 撈片時注意在切片和玻片之間不要留有氣泡。撈好的切片應(yīng)在60左右烤箱內(nèi)烤至少

14、30min。以防染色時脫片。（三）石蠟切片制作時的注意事項(Attentions)1. 組織的取材和固定 ；2. 組織脫水、透明和浸蠟 ；3. 切片組織塊固定不牢時； 4. 切片刀和切片機(jī) ；5. 特殊要求切片的制作 。第三節(jié) 冰凍切片法(Frozen sectioning)冰凍切片可用于新鮮組織、甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。已固定的組織塊經(jīng)流水沖洗后再進(jìn)行切片。一、冰凍切片法（一）恒冷箱切片機(jī)提前開機(jī)預(yù)冷，一般工作溫度設(shè)定在-22左右。待刀臺、樣品臺和箱內(nèi)達(dá)到設(shè)置溫度后即可切片。順序如下：將組織用OCT粘在樣品托后放置在速凍臺上；組織凍結(jié)后，將樣品托固定到樣品臺上；調(diào)整組織切面與

15、刀刃位置，初步修出組織切面后，放下防卷板，關(guān)閉觀察窗，開始切片。切出的切片粘貼到載玻片上，直接凍存或吹干固定。（二）半導(dǎo)體制冷切片機(jī) 二、冰凍組織的取材及保存方法（一）取材負(fù)責(zé)診斷的醫(yī)師應(yīng)親自檢查大體標(biāo)本，做多切面詳細(xì)檢查，必要時可在解剖鏡下觀察。選取最具代表性的組織制片，必要時應(yīng)多點取材。如切面有特殊要求，應(yīng)向技術(shù)人員說明。取材和切片的剩余組織須進(jìn)一步做石蠟切片進(jìn)行對照，有利于病理醫(yī)師對照閱片，不斷提高觀察冰凍切片的水平。（二）保存方法組織速凍的方法很多，常用方法為液氮和干冰丙酮法。1. 液氮法：將組織塊平放于瓶蓋或標(biāo)本盒等適當(dāng)容器內(nèi)，緩慢放入盛有液氮的容器內(nèi)。當(dāng)組織塊凍結(jié)后，取出用鋁箔包好

16、，做好標(biāo)記后入液氮罐或-70低溫冰箱保存?？杀４鏀?shù)月至數(shù)年。如短期內(nèi)使用，可保存于-30冰箱。2. 干冰-丙酮法：將組織塊放入盛有OCT包埋劑的標(biāo)本盒內(nèi)，使組織塊完全浸沒。將丙酮倒入盛有10g干冰的保溫杯調(diào)成糊狀。將裝有組織塊的標(biāo)本盒放入保溫杯，待包埋劑成白色凍塊時，取出如上法保存。此法組織速凍快，組織結(jié)構(gòu)保存好。3. 異戊烷-液氮法：此法的優(yōu)點可防止冰晶破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對含水較多的組織適宜用此法進(jìn)行速凍。先用甲基纖維素包埋組織塊。將盛有異戊烷的小燒杯放入裝有液氮的大保溫杯或冰壺內(nèi)，攪拌異戊烷待杯底出現(xiàn)一層白色糊狀物時，放入包埋好的組織塊，數(shù)秒鐘即可取出，按上述方法保存。（三）注意事項

17、1. 液氮速凍時，標(biāo)本盒不能直接浸入液氮，以免組織膨脹破碎。2. 速凍的包埋劑應(yīng)適量。3. 新鮮組織不能放入-10冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否則組織內(nèi)水分可逐漸析出形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞。4. 冷凍后的組織塊應(yīng)密封保存，防止失水。5. 在組織塊復(fù)溫時，應(yīng)在37加溫速融，自然復(fù)溫將造成組織結(jié)構(gòu)破壞。第四節(jié) 脫落細(xì)胞制片技術(shù)Preparation of Exfoliative cytologic samples脫落細(xì)胞標(biāo)本包括：胸水、腹水、尿液、腦脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的細(xì)胞，在臨床上具有非常重要的診斷價值。一、細(xì)胞標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活細(xì)胞標(biāo)本的制備

18、等。(一)印片法常用于活檢和手術(shù)標(biāo)本，新鮮標(biāo)本沿病灶中心剖開，將載片輕壓于切面上，吹干后立即浸入固定液內(nèi)5l0min，取出自然干燥，低溫儲存。優(yōu)點是操作簡單，細(xì)胞抗原保存好。(二)穿刺液沉淀法常用于淋巴結(jié)、軟組織、肝、腎和肺等，穿剌液少，可直接涂片，細(xì)胞盡量涂均勻。穿刺液多，細(xì)胞豐富，可置離心管內(nèi)，以500rpm低速離心5l0min，棄上清，將沉淀制成細(xì)胞懸液(2105細(xì)胞/ml)。涂片鏡檢, 以細(xì)胞較密不重疊為好。干燥后固定。胸水、腹水、尿液和腦脊液等如細(xì)胞較少時，也可用此方法制片。此法細(xì)胞保存好，操作簡單。注意涂片時，盡量涂均勻。(三)單核細(xì)胞分離法主要用于外周血和胸腹水中淋巴細(xì)胞的分離。

19、如為血性胸腹水，經(jīng)上述方法分離淋巴細(xì)胞然后在37培養(yǎng)30min，離心沉淀取上清，制成濃度為2106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，吸50l涂片，略干后固定l0min。2022/8/2556宮頸脫落細(xì)胞涂片見分化不良細(xì)胞體積大、核深染；正常上皮細(xì)胞核小、胞漿豐富。二、血涂片的制作血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，制備厚薄適宜、分布均勻、染色良好的血涂片是血液學(xué)檢查的基本技術(shù)之一。(一)操作步驟1. 消毒：先按摩取血部位，使血流通暢；再用酒精消毒采血針和取血部位(如指尖)。2. 取血：待酒精干后，刺破皮膚，使血自然流出，勿擠。取干凈載片，讓血滴在離載片一端中45mm處，注意手指

20、持握載片的邊緣，勿觸及其表面。不能使載片接觸取血部位的皮膚。3. 推片：取一張邊緣光滑的載片。將其一端置于血滴前方，向后移動到接觸血滴，使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈3040角，向另一端平穩(wěn)地推出。涂片推好后，通過搖擺使之快速干燥。4. 染色：用特種玻璃鉛筆在血膜兩側(cè)畫兩條線，防止染液外溢。再將瑞氏染液(伊紅-亞甲基藍(lán))滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染半分鐘。加等量蒸餾水(或緩沖液)與染液混合再染5分鐘。最后用蒸餾水把染液沖掉，用吸水紙吸干，自然干燥后，即可觀察。（二）注意事項活細(xì)胞標(biāo)本制備中玻片的清洗：新玻片常有游離堿,因此應(yīng)用清洗液或10%鹽酸浸泡24h,然后再徹

21、底清洗。用過的玻片可放入適量肥皂水或合成洗滌劑的清水中煮沸20min,再用熱水將肥皂和血膜洗去，用自來水反復(fù)沖洗,必要時再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或烤干備用。一張良好的血片，要求厚薄適宜，頭體尾分明，分布均勻，邊緣整齊，兩側(cè)留有空隙。血片制好后最好立即固定染色，以免細(xì)胞溶解和發(fā)生退行性變。三、活細(xì)胞標(biāo)本的制備多用于科研，用于常規(guī)病理診斷的較少。標(biāo)本主要來源于建株的培養(yǎng)細(xì)胞，短期培養(yǎng)細(xì)胞和外周血等。細(xì)胞可直接培養(yǎng)在蓋玻片上，固定后即可進(jìn)行染色觀察或進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或掃描電鏡標(biāo)本制備。也可培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，制成細(xì)胞懸液，收集一定的細(xì)胞還可進(jìn)行涂片?？梢越?jīng)離心后，進(jìn)行透射電鏡標(biāo)本制

22、備。謝謝大家！2022/8/2562脫落細(xì)胞學(xué) 檢查 采集病變處脫落細(xì)胞固定、涂片染色后進(jìn)行觀察。如：子宮頸癌、食管癌、鼻咽癌直接采集，肺癌自然分泌物(痰)7.圖象分析技術(shù) 病理學(xué)形態(tài)觀察的一種更為精確的定量標(biāo)準(zhǔn)和方法。主要應(yīng)用于核形態(tài)參數(shù)的測定(如核直徑、周長、面積、體積、形態(tài)因子等)。 也用于區(qū)別腫瘤的良惡性、區(qū)別癌前病變和癌、腫瘤的組織病理分級和判斷預(yù)后等。 還可用于DNA倍體的測定和顯色反應(yīng)(如免疫組織化學(xué))的定量等方面。632022/8/252022/8/25643、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)的觀察： 一般稱為特殊染色，通過應(yīng)用某些能與組織細(xì)胞化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，顯示病變組織細(xì)胞的

23、化學(xué)成分(如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類等)。4、免疫組織化學(xué)觀察： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測組織中未知的抗原或抗體，借以判斷腫瘤的組織來源與分化方向。9、靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。8月-228月-22Thursday, August 25, 202210、雨中黃葉樹，燈下白頭人。17:06:5217:06:5217:068/25/2022 5:06:52 PM11、以我獨沈久，愧君相見頻。8月-2217:06:5217:06Aug-2225-Aug-2212、故人江海別，幾度隔山川。17:06:5217:06:5217:06Thursday, August 25, 202213、乍見翻

24、疑夢，相悲各問年。8月-228月-2217:06:5217:06:52August 25, 202214、他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。25 八月 20225:06:52 下午17:06:528月-2215、比不了得就不比，得不到的就不要。八月 225:06 下午8月-2217:06August 25, 202216、行動出成果，工作出財富。2022/8/25 17:06:5217:06:5225 August 202217、做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。5:06:52 下午5:06 下午17:06:528月-229、沒有失敗，只有暫時停止成功！。8月-228月-

25、22Thursday, August 25, 202210、很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。17:06:5217:06:5217:068/25/2022 5:06:52 PM11、成功就是日復(fù)一日那一點點小小努力的積累。8月-2217:06:5217:06Aug-2225-Aug-2212、世間成事，不求其絕對圓滿，留一份不足，可得無限完美。17:06:5217:06:5217:06Thursday, August 25, 202213、不知香積寺，數(shù)里入云峰。8月-228月-2217:06:5217:06:52August 25, 202214、意志堅強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。25 八月 20225:06:52 下午17:06:528月-2215、楚塞三湘接，荊門九派通。八月