1、ICS 65.150B 52DB13河北省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 13/T 14152011魚類寄生蟲性疫病診斷技術(shù)規(guī)程Diagnosis protocal for parasite epidemics of fish2011 - 06 - 15 發(fā)布2011 - 06 - 30 實(shí)施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā) 布DB13/T 14152011I前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省水產(chǎn)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張志華、侯金良、李同慶、康辰香、孫偉彬、石潔卿、馬瑞欣、邵鐵凡、寇景蓮。 PAGE 10魚類寄生蟲性疫病診斷技術(shù)規(guī)程范圍

2、本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了魚類寄生蟲性疫病即小瓜蟲病、刺激隱核蟲病、粘孢子蟲病、三代蟲病、指環(huán)蟲病的診斷技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于小瓜蟲病、刺激隱核蟲病、粘孢子蟲病、三代蟲病、指環(huán)蟲病的診斷。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊通則材料和試劑材料普通光學(xué)顯微鏡、雙筒解剖鏡、放大鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、手術(shù)刀、手術(shù)剪、解剖針、吸水紙、培養(yǎng)皿、滴管、解剖盤等。試劑0.85生理鹽水、30人工配制海水、45%和10的

3、福爾馬林、70酒精、硝酸銀、甘油膠胨、肖氏液、聚乙烯醇。配置試劑用水應(yīng)符合GB/T 6682的要求。采樣量用于檢查診斷的魚應(yīng)有一定數(shù)量，檢查時(shí)采集的樣品至少5尾10尾。也可按照OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊的采樣方法進(jìn)行采樣，見附錄A。樣品及運(yùn)輸用于實(shí)驗(yàn)室檢查的病魚應(yīng)是活體，運(yùn)輸時(shí)應(yīng)在采集的病魚中加注原池水進(jìn)行活體運(yùn)輸。每個(gè)容器只裝運(yùn)同一種病魚送至實(shí)驗(yàn)室。運(yùn)輸過程中應(yīng)采取充氧、降溫等措施。病原體記數(shù)按不同感染部位采集組織，進(jìn)行觀察。記錄顯微鏡檢查時(shí)的倍數(shù)和該倍數(shù)下的蟲體數(shù)量。孢囊用數(shù)字說明，蟲體數(shù)為同一玻片中3個(gè)視野的平均數(shù)。小瓜蟲病病原種類特征見附錄B?，F(xiàn)場樣品目檢檢查魚體。病魚體色發(fā)黑，消瘦，

4、游動(dòng)異常，體表或鰓上可見1 mm左右的小白點(diǎn)，病情嚴(yán)重時(shí)， 魚體表伴大量粘液，用鑷子刮下白點(diǎn)或粘液，放在解剖盤上，滴一滴生理鹽水，靜置1 min2 min， 在光亮的地方仔細(xì)觀察，如果見到一個(gè)個(gè)白色小圓球在慢慢地游動(dòng)，且大多數(shù)集中在水滴的邊緣，根據(jù)上述的癥狀可以初步確診。實(shí)驗(yàn)室檢測及標(biāo)本保存體表用解剖刀刮取體表兩側(cè)粘液，置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，用鑷子將組織粘液分散，蓋上蓋玻片，用拇指輕輕壓片，在顯微鏡或解剖鏡下檢查。鰭目檢正常的魚，剪下各鰭，置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，解剖鏡下檢查。目檢魚體各鰭如有潰爛或白點(diǎn)，用鑷子刮取潰爛或白點(diǎn)部位，置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，用蓋玻片蓋上輕壓，解

5、剖鏡或顯微鏡下檢查。鰓用剪刀將左右兩邊的鰓完整地取出，放在培養(yǎng)皿里（要分開放置），并附上左右標(biāo)記。剪取一小塊鰓組織（應(yīng)從每一邊鰓的第一片鰓片接近兩端的位置剪?。?，放在載玻片上，滴一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，在解剖鏡或顯微鏡下檢查。如鰓上肉眼可見白點(diǎn)或孢囊，則用鑷子刮取白點(diǎn)或孢囊，或取整片鰓絲壓片，顯微鏡下檢查。蟲體收集保存見附錄C。結(jié)果判定目檢癥狀結(jié)合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內(nèi)小瓜蟲計(jì)數(shù)達(dá)到10個(gè)及10個(gè)以上時(shí)，判定為小瓜蟲病；小瓜蟲計(jì)數(shù)不足10個(gè)時(shí)，判定為小瓜蟲感染。刺激隱核蟲病病原種類特征見附錄B?，F(xiàn)場樣品目檢滴加試劑為30人工配制海水，其他步驟同4.2。實(shí)驗(yàn)室檢測及標(biāo)本保存診

6、斷時(shí)滴加試劑為30人工配制海水，其他步驟同4.3。結(jié)果判定目檢癥狀結(jié)合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內(nèi)刺激隱核蟲計(jì)數(shù)達(dá)到10個(gè)及10個(gè)以上時(shí)，判定為刺激隱核蟲??；刺激隱核蟲計(jì)數(shù)不足10個(gè)時(shí)，判定為刺激隱核蟲感染。粘孢子蟲病病原種類特征見附錄B?，F(xiàn)場樣品目檢粘孢子蟲的多數(shù)種類，寄生于魚的體表、鰓、腸道及體腔，都表現(xiàn)出肉眼可見的癥狀，即白點(diǎn)狀或白色的瘤狀孢囊，孢囊形狀和大小不規(guī)則，顏色灰白而不透明。用鑷子取下一個(gè)孢囊放在載玻片上，滴一滴生理鹽水，用蓋玻片蓋上輕壓，如孢囊破裂并流出乳白色液體，可初步診斷為粘孢子蟲病。實(shí)驗(yàn)室檢測及標(biāo)本保存鏡檢在400倍顯微鏡下，壓破的孢囊液體中清晰可見孢子，可診斷

7、為粘孢子蟲病。一個(gè)孢囊中有成千上萬個(gè)孢子蟲。體表檢查體表，用解剖刀刮取鱗片下的瘤狀物，置于載玻片上，加一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，顯微鏡下檢查。鰭檢查方法參見4.3.2，鏡檢倍數(shù)為400倍。鰓檢查方法參見4.3.3，鏡檢倍數(shù)為400倍。體腔打開魚體腹腔，仔細(xì)觀察顯露出的部位有無可疑病變。如發(fā)現(xiàn)白點(diǎn)，或較大孢囊，有可能是粘孢子蟲寄生。用鑷子刮取白點(diǎn)部位或孢囊置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，見孢囊破裂后， 顯微鏡下檢查。腸道將腸道外壁上所有脂肪去除干凈，把腸前后伸直擺在解剖盤上。將腸分為前、中、后三段，各取一段，用剪刀從與腸平行的方向剪開一個(gè)小小切口，用鑷子從切口上取一小滴內(nèi)容物放

8、在載玻片上，滴一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片輕壓，顯微鏡下檢查，每段同時(shí)檢查兩片標(biāo)本。剪開腸道后，如見白點(diǎn)或孢囊附著，直接用解剖刀刮取白點(diǎn)或孢囊于在載玻片上，壓片后，顯微鏡下檢查。蟲體收集保存見附錄C。病原體記數(shù)及結(jié)果判定病原體記數(shù)計(jì)數(shù)符號用“+”表示：“+”表示有；“+”表示多；“+”表示很多。高倍顯微鏡 400 倍一個(gè)視野下，有 1 個(gè)20 個(gè)蟲體時(shí)記“+”，21 個(gè)50 個(gè)蟲體時(shí)記“+”， 50 個(gè)以上的蟲體時(shí)記“+”。結(jié)果判定檢出粘孢子蟲則判定為粘孢子蟲病。三代蟲病病原種類特征見附錄B。現(xiàn)場樣品目檢當(dāng)蟲體大量寄生時(shí)，病魚體表可見一層灰白色的粘液，魚體失去光澤，游動(dòng)極不正常。實(shí)驗(yàn)室檢測及標(biāo)本保

9、存該病不會(huì)出現(xiàn)白點(diǎn)或孢囊，無須此步檢測。其他步驟參見4.3。結(jié)果判定目檢癥狀結(jié)合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內(nèi)三代蟲計(jì)數(shù)達(dá)到5個(gè)及5個(gè)以上時(shí)，判定為三代蟲病；三代蟲計(jì)數(shù)不足5個(gè)時(shí)，判定為三代蟲感染。指環(huán)蟲病病原種類特征見附錄B。現(xiàn)場樣品目檢同7.2。實(shí)驗(yàn)室檢測及標(biāo)本保存同7.3。結(jié)果判定目檢癥狀結(jié)合鏡下觀察，40倍顯微鏡下平均每視野內(nèi)指環(huán)蟲計(jì)數(shù)達(dá)到5個(gè)及5個(gè)以上時(shí)，判定為指環(huán)蟲??；指環(huán)蟲計(jì)數(shù)不足5個(gè)時(shí)，判定為指環(huán)蟲感染。附錄A（資料性附錄） 采樣數(shù)量表A.1檢疫采樣數(shù)量表魚群大小2感染率時(shí)取樣5感染率時(shí)取樣10感染率時(shí)取樣505035201007545232501105025500130

10、552610001405527150014055272000145602740001456027100001456027100000 或以上1506030注：檢疫采樣應(yīng)采集全部實(shí)驗(yàn)室樣品。附錄B（資料性附錄） 病原種類特征多子小瓜蟲成蟲期蟲體一般呈卵形或球形，大小(350800)m(300500) m，胞口在接近前端的腹面上。大核香腸狀或馬蹄狀，小核緊帖大核上，細(xì)胞質(zhì)有很多小的伸縮泡和一些食物粒。幼蟲期身體一般呈橢圓形，隨著發(fā)育時(shí)間的延長身體逐漸變長，變成扁鞋底狀，在前端有一乳頭狀突起， 叫鉆孔器，前端較圓，除身體后端有1根特長的尾毛外，周身長著長短一致的纖毛。在腹面稍前的位置， 有1個(gè)近似“

11、6”字形的小胞口。在身體前半部有一個(gè)大的伸縮泡。包囊期離開魚體的蟲體或越出囊泡的蟲體，可作3 h6 h的游泳，然后沉入水底的物體上，靜止之后，分泌一層膠質(zhì)厚膜將蟲體包圍即是包囊。包囊圓形或橢圓形，白色透明。刺激隱核蟲寄生滋養(yǎng)體成熟的蟲體呈球形或卵圓形，直徑約300 m500 m，顯微鏡下常呈乳白色，體被纖毛，表面有脊?fàn)钔黄穑谖挥谏眢w的前端，體內(nèi)有4個(gè)8個(gè)卵圓形團(tuán)塊連接成“”字形排列的念珠狀大核。蟲體會(huì)隨運(yùn)動(dòng)改變形狀。胞囊蟲體從宿主體表脫落后，纖毛退化，表面的脊?fàn)钔黄鹱兤剑纬珊癖诎?，大小?4.5 m170 m252 m441 m。幼蟲卵圓形或紡錘型，前端稍尖，大小為20 m30 m50

12、 m70 m，其形態(tài)大小隨地域、宿主種類和溫度的不同而有所變化。粘孢子蟲主要致病種類有：變異粘體蟲（M. varia Achmerov Nie & Lee, 1964)營養(yǎng)體外觀不規(guī)則，大小不一。成熟孢子殼面觀為橢圓形，前端較后端寬或鈍圓。后端殼緣光滑， 或有45個(gè)V形皺褶。極囊2個(gè)，梨形或卵圓形，大小相等，平行排列于前方，約占孢子長的1/2。少數(shù)極囊不等，斜向排列于前。極絲在極囊內(nèi)盤繞59圈。孢中質(zhì)有圓形胚核2個(gè)。無嗜碘泡。頂面觀紡錘形。縫面觀亦為紡錘形，縫脊直或稍彎曲。孢子長9 m13 m，寬6 m8.5 m。孢囊形狀大小不一，有橢圓形、扇形塊狀、長條形或分枝不規(guī)則等。中華粘體蟲（M. s

13、inensis Nie & Lee, 1964)成熟的孢子圓形，前方稍尖，后方鈍圓，縫脊直。兩個(gè)梨形極囊同等大小。無嗜碘泡。感染的魚腸道內(nèi)壁或外壁形成乳白色芝麻狀孢囊。鰱碘泡蟲（M. drjagini）(1954)(Schulman,1962)營養(yǎng)體直徑4.8 m16.0 m.。孢子殼面觀橢圓或倒卵形，前寬而后稍狹。殼面光滑或有45個(gè)V 形的褶皺，囊間有明顯V形小塊。孢子長12.3 m，寬9.0 m。極囊2個(gè)，梨形，通常大極囊傾斜地位于孢子前方。餅形碘泡蟲（M. artua Achmerov, 1960)孢囊白色，圓形或橢圓形，長42 m89.2 m，寬31.5 m73.5 m。孢子殼面觀為圓

14、形，縱軸小于橫軸，孢子后方有不甚明顯的褶皺。縫面觀紡錘形。孢子長4.8 m6.0 m。2個(gè)卵圓形的極囊大小相等，呈八字形排列。異型碘泡蟲（M. dispar Theolohan, 1895)孢子橢圓形，縫脊直而明顯，兩個(gè)梨形極囊大小不等，彼此有一定間隔，有一個(gè)明顯的嗜碘泡。孢囊大小為29.7 m39.2 m195.8 m230 m。鯪單極蟲（T. rohitae）(Southwell & Prashad, 1918)著生于魚體鱗片下，白色或蠟黃色，孢囊大小形狀不一，有圓形、橢圓形、長方形或多角形，其長可達(dá)32 mm，短的有5 mm。孢子長29.8 m35 m，寬7 m12.3 m，極囊長19

15、m25 m，寬為7 m，呈長卵形，約占孢子長的1/31/2。嗜碘泡1個(gè)。孢子外面常被有一層無色透明的薄膜。三代蟲主要致病種類有：鰱三代蟲（G.hypopthalmichthysi Ling）主要寄生于鰱、鳙的皮膚、鰭、鰓及口腔。無眼點(diǎn)，體長0.32 mm0.51 mm，寬0.07 mm0.14 mm 前端有頭器1對。后吸器上的8對邊緣小鉤排列呈傘狀，中央大鉤1對，2片聯(lián)結(jié)片。口在身體前端腹面， 呈管狀或漏斗狀。咽由16個(gè)大細(xì)胞構(gòu)成，葫蘆狀。食道很短，腸支伸至體后的4/5處。睪丸位于體后部中間。交配囊卵圓形，由1根大而彎曲的大刺和8根刺組成。卵巢單個(gè)，呈新月形，在睪丸之后。秀麗三代蟲（G.ele

16、ganse Nordmann）主要寄生于鯉、鯽及金魚。無眼點(diǎn)，在蟲體的中部，可見到胚胎，有時(shí)甚至可見到“連續(xù)四代”在一起。鯇三代蟲（G.ctenopharyngodontis Ling）主要寄生于草魚皮膚和鰓上。無眼點(diǎn)，蟲體較大，為0.33 mm0.57 mm0.090.15 mm，兩端的前緣常各具有一尖刺狀的突起。指環(huán)蟲指環(huán)蟲屬的主要特征：后吸器具7對邊緣小鉤，1對中央大鉤。聯(lián)結(jié)片存在，輔助片存在或缺失。體前端具眼點(diǎn)2對，具貯精囊，前列腺儲(chǔ)囊1對。主要致病種類有：頁形指環(huán)蟲（Dactylogyrus lamellatus Achmerov）主要寄生于草魚鰓、皮膚和鰭。蟲體扁平，大小為0.19

17、2 mm0.529 mm0.072 mm0.136 mm， 具眼點(diǎn)及頭器各2對。鳙指環(huán)蟲（Dactylogyrus aristichthys Long & Yu）主要寄生于鳙魚鰓部。具7對邊緣小鉤，中央大鉤基部較寬，內(nèi)外突明顯。聯(lián)結(jié)片略呈倒“山”字形，輔助片稍似菱角狀，左右兩部分較細(xì)長。小鞘指環(huán)蟲（Dactylogyrus vaginulatus Tchang & Niu）主要寄生于鰱魚鰓上，為較大型的指環(huán)蟲，可達(dá)0.98 mm1.4 mm0.233 mm0.344 mm。中央大鉤粗壯，全長0.054 mm0.066 mm。壞鰓指環(huán)蟲（Dactylogyrus vastator Nybelin）主要寄生于鯉魚、鯽魚、金魚的鰓絲。聯(lián)結(jié)片單一，呈“一”字行。附錄C（資料性附錄）蟲體標(biāo)本收集方法及保存小瓜蟲、刺激隱核蟲用45福爾馬林保存帶有蟲體的組織。制備干片保存：將有病原體的含有物涂在載玻片上，空氣中干燥后進(jìn)行染色（硝酸銀法染色），用以觀察蟲體的纖毛線。粘孢子蟲把孢囊取出，壓