實(shí)驗(yàn)七豬圓環(huán)病毒病PCR診斷第一頁，共二十二頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟；2、掌握豬圓環(huán)病毒PCR檢測的方法；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、講述PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟，2、豬細(xì)小病毒PCR檢測。第二頁，共二十二頁。什么是PCR？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟第三頁，共二十二頁。PCR原理PCR是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。第四頁，共二十二頁。PCR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸3個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)（2530次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴(kuò)增。第五頁，共二十二頁。反應(yīng)程序變性：93-94℃2min變性：93-94℃30s復(fù)性：55-65℃30s延伸：72℃30s延伸：72℃2min35個(gè)循環(huán)第六頁，共二十二頁。PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension第七頁，共二十二頁。PCRproduct第八頁，共二十二頁。標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul第九頁，共二十二頁。第十頁，共二十二頁。酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少第十一頁，共二十二頁。引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增第十二頁，共二十二頁。引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)址：primer/primer3_www.cgi第十三頁，共二十二頁。第十四頁，共二十二頁。第十五頁，共二十二頁。PCR產(chǎn)物分析凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。同時(shí)應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照。第十六頁，共二十二頁。二豬圓環(huán)病毒感染PCR檢測-試劑盒圓環(huán)病毒（PCV）第十七頁，共二十二頁。第十八頁，共二十二頁。使用方法第十九頁，共二十二頁。注意事項(xiàng)：第二十頁，共二十二頁。作業(yè)1、敘述PCR反應(yīng)的原理、操作方法及注意事項(xiàng)。2、敘述豬圓環(huán)病毒感染PCR檢測的方法及結(jié)果判定。第二十一頁，共二十二頁。內(nèi)容梗概實(shí)驗(yàn)七豬圓環(huán)病毒病PCR診斷。實(shí)驗(yàn)七豬圓環(huán)病毒病PCR診斷。1、講述PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟，。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。復(fù)性：55-65℃30s。延伸：72℃2min。10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至