第四節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏2022/10/101第四節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏2022/10/91性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。2022/10/102性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作2022/10/92一、菌種的衰退與復(fù)壯

（一）衰退

1.定義

衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而是某物種原有一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。菌種的衰退是發(fā)生在微生物細(xì)胞群中的一個由量變到質(zhì)變的逐步演化過程。2022/10/103一、菌種的衰退與復(fù)壯

（一）衰退

1.定義菌種原有的典型性狀變得不典型時就稱菌種退化，這種變異也稱負(fù)變（minusmutation）。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染；c）死亡；2022/10/104菌種原有的典型性狀變得不典型時就稱菌種退化，這種變異例如，微生物菌落形態(tài)或個體形態(tài)的變化；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子量減少；色素產(chǎn)生情況的變化；研究菌種遺傳標(biāo)記的丟失，生產(chǎn)菌種生產(chǎn)性狀的劣化等。2022/10/105例如，2022/10/952.衰退的原因造成菌種退化的主要原因是基因突變。誤區(qū)生產(chǎn)工藝條件控制不當(dāng)雜菌污染造成生產(chǎn)性能下降飾變2022/10/1062.衰退的原因造成菌種退化的主要原因是基因突變。誤區(qū)生產(chǎn)工3.衰退的防止（1）選育生產(chǎn)性能穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌株經(jīng)誘變等處理后的菌種要連續(xù)傳代、分離純化，防止分離回復(fù)。（2）控制傳代次數(shù)盡量避免不必要的移種和傳代，并將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的幾率。2022/10/1073.衰退的防止（1）選育生產(chǎn)性能穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌株經(jīng)誘（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退；例如，給予營養(yǎng)缺陷型適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)必需成分，可降低回復(fù)突變頻率。2022/10/108（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個適合原種的生長條件，就可在一（4）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代放線菌和霉菌一般用單核的孢子接種的，菌絲細(xì)胞常含有幾個細(xì)胞核，甚至是由異核體組成的，用于接種就易出現(xiàn)離異（dissociation）或衰退。例如，構(gòu)巢曲霉如用分生孢子接種易退化；如用子囊孢子接種則不易退化。2022/10/109（4）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代放線菌和霉菌一般（5）采用有效的菌種保藏方法菌種保藏的溫度、所用的培養(yǎng)基等可影響自發(fā)突變。2022/10/1010（5）采用有效的菌種保藏方法菌種保藏的溫度、所用的培養(yǎng)基等可（二）菌種的復(fù)壯（rejuvenation）

1.定義狹義的復(fù)壯：是指菌種已發(fā)生衰退后，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。是一種消極的措施2022/10/1011（二）菌種的復(fù)壯（rejuvenation）

1.定廣義的復(fù)壯：在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個體。是一項(xiàng)積極的措施2022/10/1012廣義的復(fù)壯：是一項(xiàng)積極的措施2022/10/912通過純種分離把退化菌種的細(xì)胞群中仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來，擴(kuò)大培養(yǎng)，就可恢復(fù)正常。（1）純種分離法（purecultureisolation）1.復(fù)壯的方法2022/10/1013通過純種分離把退化菌種的細(xì)胞群中仍保持原有典型性狀的純種分離的方法“菌落純”水平（purecultureincolonylever）“菌株純”水平（purecultureinstrainlever）粗放精細(xì)2022/10/1014純種分離的方法“菌落純”水平（pureculturein2022/10/10152022/10/915（2）通過宿主體復(fù)壯針對病原菌從典型的病灶部分分離到恢復(fù)原始獨(dú)立的復(fù)壯菌株衰退的病原菌接種相應(yīng)的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)活的“選擇性培養(yǎng)基”多次選擇2022/10/1016（2）通過宿主體復(fù)壯針對病原菌從典型的病灶部分分離到（3）淘汰已衰退的個體

S.microflavus“5406”農(nóng)用抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低溫處理5～7天，退化的個體死亡，留下的10％～20％個體是未退化的。2022/10/1017（3）淘汰已衰退的個體S.microfl二、菌種的保藏菌種（culture，stockculture）是一種極其重要和珍貴的生物資源。菌種保藏（preservation，conservation，maintenance）是一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)性工作。2022/10/1018二、菌種的保藏菌種（culture，stockcultur在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：用于長期保藏的原始菌種稱為保藏菌種或原種（stochculture）。2022/10/1019在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：用于長期保藏的原任務(wù)：廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)用菌種、菌株、病毒毒株（有時還包括動、植物的細(xì)胞株和微生物質(zhì)粒等），并將它們妥善保藏，使之不死、不衰、不亂，便于研究、交換和使用。國家設(shè)立專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)2022/10/1020任務(wù)：國家設(shè)立專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)2022/10/9201.菌種保藏的原理首先，要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體進(jìn)行保藏。其次，創(chuàng)造一個使微生物代謝不活潑、生長受抑制的環(huán)境條件。再次，添加保護(hù)劑或酸堿中和劑，避免保藏過程中細(xì)胞受傷。2022/10/10211.菌種保藏的原理首先，要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用2.菌種保藏的方法一種良好的菌種保藏方法保持原菌的優(yōu)良性狀長期穩(wěn)定方法的通用性操作的簡便性設(shè)備的普及性2022/10/10222.菌種保藏的方法一種良好的菌種保藏方法保持原菌的優(yōu)良性狀2022/10/10232022/10/923（1）定期移植保藏法操作方法：將菌種接種在斜面、液體或穿刺培養(yǎng)基上，待生長完全后，置普通冰箱4℃保藏，濕度50％～70％以下，棉塞換成不通氣橡皮塞更好。2022/10/1024（1）定期移植保藏法操作方法：2022/10/924優(yōu)點(diǎn)：方便，不受條件限制，各類微生物均可。缺點(diǎn)：時間短、傳代多、易退化。低溫可減緩生長速度，單細(xì)胞仍有一定的活動條件，一般4～6個月必須傳代一次。2022/10/1025優(yōu)點(diǎn)：方便，不受條件限制，各類微生物均可。低溫可減緩生長速度（2）液體石蠟法操作方法：生長完全的斜面上覆蓋無菌的液體石蠟，液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。2022/10/1026（2）液體石蠟法操作方法：2022/10/926加上石蠟可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，也可隔氧，保藏時間1～2年，除石油發(fā)酵微生物外，各類微生物均可使用。注意：石蠟的純度2022/10/1027加上石蠟可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，也可隔氧，保藏時間1～2年，除（3）砂土保藏法操作方法：沙和土用酸浸泡去除其中的有機(jī)質(zhì)，洗滌中和，干燥，分裝于安瓶管內(nèi)，加塞滅菌，把健壯的孢子懸液滴于砂土中攪拌均勻，真空干燥后封口，置于冰箱或干燥器中。2022/10/1028（3）砂土保藏法操作方法：2022/10/928優(yōu)點(diǎn)：低溫、干燥、無氧、無營養(yǎng)，保藏效果好，時間可達(dá)幾年至數(shù)十年。缺點(diǎn)：只適用于產(chǎn)孢子的微生物，不能用于保藏營養(yǎng)細(xì)胞。2022/10/1029優(yōu)點(diǎn)：低溫、干燥、無氧、無營養(yǎng)，保藏效果好，時間可達(dá)幾年至數(shù)（4）冷凍干燥保藏法操作方法：是將液體樣品（含保護(hù)劑的菌懸液）在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中水分，最后達(dá)到干燥。培養(yǎng)物用無菌脫脂牛奶—保護(hù)劑制成菌懸液，加入安瓶中，冷凍、抽真空、封口。2022/10/1030（4）冷凍干燥保藏法操作方法：2022/10/9302022/10/10312022/10/9312022/10/10322022/10/932優(yōu)點(diǎn)：低溫、干燥、無氧、有保護(hù)劑，可保藏各大類微生物，保藏時間可達(dá)幾十年，是目前使用最廣、最有效的保藏方法。一般專業(yè)機(jī)構(gòu)大都使用此法保藏。缺點(diǎn)：不能保藏真菌菌絲。2022/10/1033優(yōu)點(diǎn)：低溫、干燥、無氧、有保護(hù)劑，可保藏各大類微生物，保藏時（5）液氮保藏法操作方法：液氮溫度可達(dá)－196℃。把菌懸液密封于安瓶中，置液氮罐內(nèi)保藏。優(yōu)點(diǎn)：保藏效果好。缺點(diǎn)：價格昂貴。2022/10/1034（5）液氮保藏法操作方法：優(yōu)點(diǎn)：保藏效果好。2022/10/（6）基因工程菌保藏攜帶外源基因的重組質(zhì)粒通常是不穩(wěn)定的，容易丟失。一般情況，細(xì)胞丟失了質(zhì)粒，生長會加快?；蚬こ叹谋２厥抢迷诳剐耘囵B(yǎng)基中只有含重組質(zhì)粒的細(xì)胞才能生長的原理。2022/10/1035（6）基因工程菌保藏攜帶外源基因的重組質(zhì)粒通常是不穩(wěn)定的，容例如，外源DNA插入到質(zhì)粒pBR322中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli中，使其含有Ampr和Tetr，因此在培養(yǎng)基中加入Ampicillin（氨芐青霉素）和Tetacyclin（四環(huán)素），即可選出含有質(zhì)粒pBR322的細(xì)胞。2022/10/1036例如，外源DNA插入到質(zhì)粒pBR322中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。2022/10/1037由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的2022/10/10382022/10/938三、菌種保藏機(jī)構(gòu)

（一）國內(nèi)1978年7月，中國微生物菌種保藏管理委員會（CCCCM）在北京成立。2022/10/1039三、菌種保藏機(jī)構(gòu)

（一）國內(nèi)1978年下設(shè)六個全國性菌種保藏管理中心1.普通微生物菌種保藏管理中心中科院微生物研究所：細(xì)菌、真菌中科院武漢病毒研究所：病毒2.農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農(nóng)科院3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心輕工部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所2022/10/1040下設(shè)六個全國性菌種保藏管理中心2022/10/9404.

醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心衛(wèi)生部藥品生物檢定所：細(xì)菌中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所：真菌中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所：病毒5.

抗生素菌種保藏管理中心國家醫(yī)藥總局四川抗生素研究所：新抗生素菌種華北制藥廠抗生素研究所：生產(chǎn)用抗生素菌種6.

獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2022/10/10414.醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心2022/10/941（二）國外1.國際性機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會（WFCC）2.美國美國典型菌種收藏館（ATCC）農(nóng)業(yè)研究服務(wù)處菌種收藏館（ARS）2022/10/1042（二）國外1.國際性機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會（WFCC）2.3.荷蘭真菌中心保藏所（CBS）4.英國國立典型菌種收藏館（NCTC）英聯(lián)邦真菌研究所（CMI）國立工業(yè)細(xì)菌收藏所（NC