Liposome脂質(zhì)體表征課件第1頁/共46頁背景介紹第2頁/共46頁

脂質(zhì)體(liposomes)：將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊。也稱類脂小球或液晶微囊。

脂質(zhì)體的概念第3頁/共46頁磷脂親水的頭部磷酸骨架水溶性分子（膽堿、絲氨酸、季胺鹽等）疏水的尾部膽固醇脂質(zhì)體兩條脂肪酸鏈，（10-24個C原子，0-6個雙鍵）

磷脂結構示意圖膽固醇的結構圖脂質(zhì)體的組成第4頁/共46頁雙分子結構：磷脂分子的親水端呈彎曲的弧形，形似“手杖”，與膽固醇分子的親水基團

相結合，形成“U”形結構。兩個“U”形結構相對排列，則形成雙分子結構卵磷脂與膽固醇在脂質(zhì)體中的排列形式膽固醇與磷脂的排列示意圖脂質(zhì)體的結構第5頁/共46頁脂質(zhì)體形成示意圖脂質(zhì)體的形成第6頁/共46頁LiposomesMicelles脂質(zhì)體與膠束的區(qū)別脂質(zhì)體膠束組成磷脂和膽固醇表面活性劑結構雙分子層單分子層中心區(qū)域水相，可容納親水性藥物疏水區(qū)，可容納疏水性藥物第7頁/共46頁脂質(zhì)體的分類第8頁/共46頁單室脂質(zhì)體小單室SUV

20-100nm大單室LUV100-1000nm多室脂質(zhì)體MLV

1~5μm洋蔥式、管狀、球形、橢球形結構和粒徑脂質(zhì)體的分類-結構和粒徑多囊脂質(zhì)體MVV

1~5μm緩釋效應和儲庫效應洋蔥式管狀球形、橢球形多囊Akbarzadehetal.NanoscaleResearchLetters.2013,8:102第9頁/共46頁脂質(zhì)體材料中性磷脂負電荷磷脂（酸性磷脂）正電荷脂質(zhì)膽固醇（Ch)大豆甾醇及其葡萄糖苷磷脂酰膽堿（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）鞘磷脂（SM）磷脂酸（PA）磷脂酰甘油（PG）磷脂酰肌醇(PI)磷脂酰絲氨酸(PS)硬脂酰胺（SA）膽固醇衍生物大豆甾醇葡萄糖苷(SG）大豆甾醇SS脂質(zhì)體的材料不同材料，形成不同結構的脂質(zhì)體第10頁/共46頁⑴磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)脂質(zhì)體的材料-中性磷脂(a)全飽和磷脂

（緊密排列）(b)非飽和磷脂（不能緊密列）磷脂脂肪鏈的飽和度對磷脂膜排列的影響①天然的PCa.

從蛋黃、大豆、牛心臟和脊髓提取b.每一種PC具有不同長度、不同飽和度的脂肪鏈植物性PC的脂肪鏈具有高度不飽和性動物性PC的脂肪鏈大部分是飽和的②合成的PC

二棕櫚酰膽堿（DPPC)、

二硬脂酰膽堿(DSPC)二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPC)第11頁/共46頁

特性：頭部基團?。?/p>

非飽和的PE容易形成非雙層結構型

--六角相（制備特殊脂質(zhì)體）六角相磷脂酰乙醇胺（PE）脂質(zhì)體的材料-中性磷脂⑵磷脂酰乙醇胺(phosphatidethanolamine,PE)第12頁/共46頁特性：酰胺鍵和羥基基團之間形成氫鍵相互作用，因此，比PC具有更高秩序的膠相。SM脂質(zhì)體的材料-中性磷脂⑶鞘磷脂（sphingomyelin,SM）第13頁/共46頁

磷脂酸(phosphatidicacid,PA)

磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,

PS)負電荷磷脂（酸性磷脂）脂質(zhì)體的材料-負電荷磷脂電荷增加脂質(zhì)體透皮吸收第14頁/共46頁

磷脂酰胺(Stearamide,SA)

膽固醇衍生物CDBA和CTBBA脂質(zhì)體的材料-正電荷脂質(zhì)LiuXM,YangB,etc.BiochimBiophysActa,2005,1720(1-2),28-34.LiuXM,YangB,etc.ChemMater,2005,17(11),2792-2795.第15頁/共46頁包裹物質(zhì)脂溶性藥物定位于雙分子層脂質(zhì)膜間兩性化合物定位于水相與膜內(nèi)部交界磷脂上水溶性藥物

包裹在水相不能包裹物質(zhì)在水相和有機溶劑中都不溶的物質(zhì)

在兩種介質(zhì)中溶解性都非常好的物質(zhì)

脂質(zhì)體的包裹作用機理單室脂質(zhì)體多室脂質(zhì)體第16頁/共46頁脂質(zhì)體與細胞的相互作用：吸附、脂交換、內(nèi)吞、融合脂質(zhì)體與細胞的相互作用第17頁/共46頁在護膚品領域，一般是指用卵磷脂類形成雙分子層微囊，把需要被皮膚吸收利用的原料包裹在其中；將對皮膚有養(yǎng)護作用的原料，用卵磷脂包裹后，有這樣幾個好處：提高吸收效率脂質(zhì)體細胞膜的磷脂雙分子層的結構非常接近，提高脂質(zhì)體的經(jīng)皮吸收效率。對被包裹物質(zhì)提供保護脂質(zhì)體可以將油性原料分散在親油層中，也可以將水性原料包裹在脂質(zhì)體球心。而磷脂則可以將有效成分與空氣隔離開，使有效成分更長久的保存，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，也可以延長涂抹在皮膚上后的有效時間。降低配方難度由于卵磷脂獨特的親油親水性，脂質(zhì)體可以隨意分散在水中，不增加乳化工作。脂質(zhì)體作為化妝品載體的應用原理第18頁/共46頁亮劍之旅拓展訓練課程磷脂藥物復合物磷脂凝膠脂質(zhì)體前體化妝品領域衍生的脂質(zhì)體類型脂質(zhì)體

形式柔性脂質(zhì)體角質(zhì)脂質(zhì)體醇質(zhì)體脂質(zhì)體變換形式化妝品：脂質(zhì)體的透皮吸收和緩釋作用是重點，修復性，保護性，增效性膏霜類化妝品一般加多室或多囊脂質(zhì)體第19頁/共46頁脂質(zhì)體的理化性質(zhì)第20頁/共46頁相變溫度(phasetransitiontemperature,Tc)

脂質(zhì)體升高溫度至一定溫度膜的物理性質(zhì)改變膜的橫切面增加、雙分子層厚度減少、膜流動性增加

脂質(zhì)雙分子層中?；鶄孺溑帕懈淖?/p>

有序排列變?yōu)闊o序排列

相變溫度Tc脂質(zhì)體的理化性質(zhì)—相變溫度Tc第21頁/共46頁Tc以下時，為“膠晶態(tài)”（脂肪鏈全反式，排列緊密，剛性和厚度增加）Tc以上時，為“液晶態(tài)”（脂肪鏈伸縮、彎曲、外扭）磷脂發(fā)生相變時，“膠晶態(tài)”“液晶態(tài)”“液態(tài)”共存，出現(xiàn)相分離，使膜的流動性增加，易導致內(nèi)容物泄漏。相變溫度與脂質(zhì)體膜穩(wěn)定性脂質(zhì)體的理化性質(zhì)—相變溫度Tc第22頁/共46頁脂質(zhì)體應用的局限性—穩(wěn)定性形貌粒度Zeta電位包封率磷脂含量第23頁/共46頁脂質(zhì)體表征電鏡法第24頁/共46頁常規(guī)電鏡法Fig1脂質(zhì)體的TEM測試項目樣品制備缺點局限性常規(guī)TEM1.樣品一般需要使用磷鎢酸染色（負染）2.將樣品用稀釋到合適的濃度，1Wt%左右3.用毛細管滴到銅網(wǎng)上，晾干或烘干1.脂質(zhì)體干燥過程中會發(fā)生結構變化。2.對小顆粒分辨率不高。100nm左右。常規(guī)SEM1.將含有脂質(zhì)體的樣品滴在干凈的硅片上面2.晾干或者烘干3.對其進行噴金處理（增強樣品的導電性）1.只能看表面結構，不能區(qū)分脂質(zhì)體和其它納米顆粒2.脂質(zhì)體不導電，需要噴金處理。AFM1.把樣品稀釋為濃度1Wt%左右2.樣品滴在云母片上3.放置待溶劑揮發(fā)干后進行測試只能看表面結構，X,Y軸不靈敏，分辨率低探針難控制Fig1

脂質(zhì)體的TEMFig3脂質(zhì)體的AFMFig2脂質(zhì)體的SEM常規(guī)電鏡法缺點：1.樣品干燥后失去原貌2.分辨率不高，不能區(qū)分脂質(zhì)體和其他納米顆粒。AlineFXavier,DaianaKDeda2,,etal.IJABPT,2016,7(2),303-313RuanLP,ZhangHY,LuoHL,etal.ScienceinChinaSeriesB:Chemistry,2009第25頁/共46頁方案一：冷凍制樣及掃描電鏡傳輸系統(tǒng)(Cryo-SEM)低溫掃描電鏡樣品制備及觀測過程樣品獨立制備與分析：鍍膜儀真空鍍膜后保持真空狀態(tài)轉(zhuǎn)移到SEM，在制備與分析之間無污染樣品轉(zhuǎn)移。保留樣品原貌分辨率較高優(yōu)勢缺點：只能觀測表面結構Cryo-TEM第26頁/共46頁方案二：冷凍制樣及透射電鏡傳輸系統(tǒng)(Cryo-TEM)低溫透射電鏡樣品制備及觀測過程高壓冷凍儀可與超薄切片機及冷凍樣品桿配合，進行低溫透射電鏡觀測測試方法：將蘸在銅網(wǎng)上的樣品溶液或分散液的液膜

急速冷凍，即在銅網(wǎng)上形成玻璃態(tài)水膜，

無冰晶產(chǎn)生。在樣品傳輸、進樣、TEM觀察的過程中始終

保持低溫。

對于囊泡類樣品的觀察，通常使用這種方法。第27頁/共46頁保留樣品原貌分辨率較高優(yōu)勢可觀測不同類型的脂質(zhì)體內(nèi)部結構+方案二：冷凍制樣及透射電鏡傳輸系統(tǒng)(Cryo-TEM)外部資源：中國科學院上海生命科學研究院中國科學院上海巴斯德研究所同濟大學SugikawaKetal.AngewandteChemieInternationalEdition,2016.JonasGustafssonetal.BiochimicaetBiophysicaActa1995第28頁/共46頁方案三：類細胞切片制樣+常規(guī)電鏡技術SEM&TEM類冷凍切片制樣法：類似冷凍切片與細胞切片制備的方法，對化妝品樣品進行固定包埋（石蠟包埋），然后進行切片，然后將其放在銅網(wǎng)或硅片上進行制樣，對脂質(zhì)體成像。分辨率能達到納米級別細胞切片法常常用來區(qū)分亞細胞結構樣品制備簡單，成本低，資源廣脂質(zhì)體的形貌大小的表征獨創(chuàng)的方法ACSappliedmaterials&interfaces,2015,7(14):7526-7533.第29頁/共46頁YigongShial.Structureofayeastspliceosomeat3.6-angstromresolution[J].Science,2015,349(6253):1182-1191.方案四：高分辨冷凍透射電鏡(HR-Cryo-TEM)2013年，冷凍電鏡技術在照相技術和軟件分析的圖像處理技術方面取得突破性進展成為施一公實驗室諾獎級工作-剪切體的結構解析的關鍵性工具HR-Cryo-TEM諾貝爾獎熱門2014年全球科技十大進展結構生物學的突破性工具最高分辨率達2.2?優(yōu)勢第30頁/共46頁區(qū)分不同結構和類型的蛋白質(zhì)分辨率達到原子水平SCIENCE

348

1147-1151

(2015)FEBSJournal280(2013)28–45區(qū)分不同結構和類型的脂質(zhì)體方案四：超高分辨冷凍透射電鏡(HR-Cryo-TEM)局限性：外部資源少國家蛋白質(zhì)科學中心-上海第31頁/共46頁脂質(zhì)體表征熒光法第32頁/共46頁方案五：膽固醇熒光標記+熒光共聚焦顯微鏡膽固醇與脂質(zhì)體異性結合，對膽固醇進行熒光修飾，通過confocal觀測熒光脂質(zhì)體結構缺點：分辨率較低，可能無法達到幾十納米級別超高分辨率熒光顯微鏡優(yōu)點：專屬性，排除其他物質(zhì)干擾，外部資源多

SungTCetal.Scientificreports,2016,6.ShiXetal.PolymerChemistry,2013第33頁/共46頁方案五：膽固醇熒光標記+熒光共聚焦顯微鏡第34頁/共46頁超高分辨率熒光顯微鏡（分辨率達到分子級別1nm左右，2014年諾貝爾化學獎）STORM技術的開創(chuàng)者莊小威2014諾貝爾化學獎方案六：膽固醇熒光標記+超高分辨熒光顯微技術StefanW.HellW.E.MoernerEricBetzig第35頁/共46頁X.Zhuang，Science3171749-1753(2007)

NatureMethods3793-795(2006)

Science319810-813(2008)

低分辨熒光顯微鏡和超高分辨熒光顯微鏡圖片的對比局限性：外部資源少方案六：膽固醇熒光標記+超高分辨熒光顯微技術優(yōu)點：突破光學極限的分辨率：1nm左右，具有專屬性，可作為通用的方法北大工學院席鵬課題組上海交大李小衛(wèi)課題組第36頁/共46頁SeeingisBelieving

分辨率非常重要大小形貌結構Conclusion:第37頁/共46頁化妝品終體系中脂質(zhì)體的表征方案一、假設脂質(zhì)體加入化妝品體系之后仍然穩(wěn)定存在，則使用Cryo-TEM或者切片法檢測，這兩種方法保留了脂質(zhì)體的原貌，理論上可以分辨出脂質(zhì)體的雙層結構。受配方體系中其他添加劑的影響不大，而且對體系純度要求不高。二、對于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法觀測不到脂質(zhì)體,不確定是否穩(wěn)定存在于體系中，可以嘗試使用熒光法。該方法對樣品純度沒有要求。如果在共聚焦顯微鏡不能看到完整的脂質(zhì)體形狀，說明脂質(zhì)體極大可能已經(jīng)被破壞，那么這樣的脂質(zhì)體在體系中發(fā)揮不了增溶的作用，已經(jīng)沒有太大的實用價值。三、如果在共聚焦顯微鏡下可以看到完整的脂質(zhì)體形狀，可以進一步嘗試高分辨Cryo-TEM或者超高分辨熒光顯微鏡進行觀察。對于復雜樣品體系，需要多種表征方法一起反復確認，以保證觀測結果的可靠性。第38頁/共46頁激光粒度儀DLS脂質(zhì)體表征第39頁/共46頁激光粒度掃描儀--水合粒徑原理：在不同的角度上測量散射光的強度，得到樣品粒度分布體積分布與數(shù)量分布之間的轉(zhuǎn)換關系顆粒平均粒徑表示方法

體積（D4,3）表面積（D3,2）數(shù)量不同顆粒均值對顆粒分布的

不同特征敏感第40頁/共46頁脂質(zhì)體的水合粒徑表征，應根據(jù)具體的樣品體系選擇合適的表示方法激光粒度掃描儀--水合粒徑第41頁/共46頁包封率脂質(zhì)體表征第42頁/共46頁脂質(zhì)體的包封率測定

方法原理特點與適用范圍缺點HPLC法參照磷脂含量測定適用范圍廣，可同時用于磷脂含量和包封率測定/透析法利用半透膜分子大小差別，通過及時更換外相達到分離的目的簡單，穩(wěn)定性好，可處理大量樣品，適合小粒徑，穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體耗時較長，所耗介質(zhì)較多微柱離心法利用游離藥物與含藥脂質(zhì)體的重力差異進行分離，計算包封率所需樣品少，適用于水溶性和脂溶性藥物，分離時間短，可用于中間過程檢測離心時間長1h以上；重現(xiàn)性差；離心力導致脂質(zhì)體中物質(zhì)滲漏凝膠柱層析法利用脂質(zhì)體與游離藥物分子質(zhì)量和粒徑大小的差異進行分離適用于脂溶性藥物，較大脂質(zhì)體粒徑