關(guān)于植物組織培養(yǎng)技術(shù)方案第一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一一、基礎(chǔ)知識1、植物的組織培養(yǎng)（1）細胞的分化①概念：在個體發(fā)育中，相同細胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程。②舉例：如：受精卵增殖、生長、分化形成組織、器官、系統(tǒng)。③特點：

a、持久性：是一種持久性的變化，它發(fā)生在生物體的整個生命過程中,在胚胎期達到最大限度；b、穩(wěn)定性：細胞分化是穩(wěn)定的，一般是不可逆轉(zhuǎn)的；c、全能性：已分化的細胞，仍具有發(fā)育的潛能。④結(jié)果：形成不同的細胞和組織。⑤原因：基因在特定的時間和空間條件下的選擇性表達的結(jié)果。第二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一（2）細胞的全能性①定義：生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特性。②原理：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因。③實例：已分化的植物細胞，仍具有全能性。高度特化的動物細胞，從整個細胞來說，全能性受到限制。但它的細胞核仍然保持著全能性，這是因為細胞核內(nèi)含有該物種遺傳性所需要的遺傳物質(zhì)。④全能性的比較:受精卵>生殖細胞>體細胞

植物細胞>動物細胞

第三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一（3）植物組織培養(yǎng)細胞離體①必要條件：一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件②原理:細胞的全能性外植體：從活植物體上切下進行培養(yǎng)的那部分細胞、組織或器官。③相關(guān)概念:脫分化：由高度分化的植物組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化或者叫去分化。再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫再分化。愈傷組織:細胞排列疏松而無規(guī)則,是高度液泡化的、成無定形狀態(tài)的薄壁細胞。第四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一人參的愈傷組織第五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一菠蘿的愈傷組織第六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一第七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一第八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一2、影響植物組織培養(yǎng)的因素（1）植物材料的選擇煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難同一植物材料的年齡、保存時間的長短會影響實驗結(jié)果菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝第九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一（2）不同的離體組織和細胞對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需配置不同的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、

Co等C、有機物、植物激素第十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。

第十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一①常用的植物激素：生長素、細胞分裂素和赤霉素生長素類：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）細胞分裂素類：激動素（KT）、6－芐基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素類：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影響第十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一②生長素和細胞分裂素作用植物中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強的趨勢使用順序?qū)嶒灲Y(jié)果先使用生長素，后使用細胞分裂素有利于細胞分裂，但不利分化先使用細胞分裂素后使用生長素細胞既分裂也分化同時使用分化頻率高第十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一生長素細胞分裂素：>有利于根的分化生長素細胞分裂素：<有利于芽的分化，抑制根的分化生長素細胞分裂素：＝促進愈傷組織生長③生長素和細胞分裂素同時使用，用量的比例對植物細胞發(fā)育方向的影響（4）pH、溫度、光照pH控制在5.8左右，溫度控制在18－22。C,每日用日光燈照射12h第十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一3、植物組織培養(yǎng)過程:離體組織或細胞植物體脫分化細胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細胞分裂素>生長素細胞分裂素<生長素再分化植物細胞培養(yǎng)不需要光需要光第十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一1、培育無病毒植株2、培養(yǎng)紫草愈傷組織,提取紫草素（治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）4、基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法4、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：3、誘導(dǎo)離體的植物組織形成具有生根發(fā)芽能力的胚狀結(jié)構(gòu)，包裹上人造種皮，制成人工種子，可以解決有些作物品種繁殖能力差，結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題第十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一人工種子第十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一二、實驗操作（一）制備MS固體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備。1、配置各種母液①無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存；②激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨配制成母液；③用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量。第十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一2、配置培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml。①配制培養(yǎng)液②調(diào)PH③培養(yǎng)基的分裝由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素。3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進行高壓蒸汽滅菌。第十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝（二）外植體消毒2、消毒①流水沖洗：菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。②酒精處理：用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精中搖動2－3次，持續(xù)6－7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗。③消毒液處理：取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液。第二十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一（三）接種污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70％的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘1、接種室消毒2、無菌操作要求操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。3、材料的切取和接種第二十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一第二十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一4、接種注意事項①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件③插入時應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分第二十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實驗嗎？答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。第二十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一（四）培養(yǎng)1、愈傷組織的培養(yǎng)從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過2周時間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見光，因為在無光條件下愈傷組織長的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)第二十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴(yán)格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長時間，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長到直徑為1－1.5cm時，就可以進行試管苗培養(yǎng)，否則還需進行第二代繼代培養(yǎng)。2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色。3、試管苗的培養(yǎng)當(dāng)愈傷組織長到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進行試管苗的見光培養(yǎng)第二十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日。1、打開封口膜2、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間。珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培。3、移栽：幼苗長壯后，移栽到土壤中（六）栽培幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。第二十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一第二十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一三、課題延伸1、一般來說，容易進行無性繁殖的植物，也容易進行組織培養(yǎng)2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季第二十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一課題2月季的花藥培養(yǎng)第三十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一一、課題目標(biāo)：說出被子植物花粉發(fā)育的過程及花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑，說出影響花藥培養(yǎng)的因素，學(xué)習(xí)花藥培養(yǎng)的基本技術(shù)，嘗試用月季或其他植物的花藥進行培養(yǎng)。二、課題重點和難點：選取適宜的培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基。三、技能目標(biāo)：知道被子植物花粉發(fā)育的過程；說出產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑；記住影響花藥培養(yǎng)的因素，嘗試花藥培養(yǎng)的實驗操作過程，并進行無菌操作；知道花藥培養(yǎng)在育種上的意義。第三十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)知識------被子植物的花粉發(fā)育：（1）雄蕊由花絲和花藥兩部分組成?；ㄋ幨切廴锏闹饕糠郑鄶?shù)被子植物的花藥由4個花粉囊組成，花粉囊外由囊壁包圍，內(nèi)生許多花粉粒。當(dāng)花粉囊的壁組織逐步發(fā)育分化時，會形成大量的花粉母細胞（小孢子母細胞）。（2）花粉粒是由花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成，因此，花粉粒是單倍體的生殖細胞?；ǚ鄣陌l(fā)育要經(jīng)歷四分體時期、單核期和雙核期等階段。第三十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一實例一：關(guān)于被子植物花粉發(fā)育的說法，不正確的是（）A、花粉粒是在花藥中的花粉囊里形成的B、被子植物精子的形成是直接減數(shù)分裂的結(jié)果C、被子植物的花粉的發(fā)育要經(jīng)歷四分體時期、單核期、雙核期等階段D、花粉粒在發(fā)育過程中，核先位于細胞一側(cè)，再移到細胞中央注：花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成4個單核花粉粒，每個花粉粒的細胞核進行一次有絲分裂形成1個花粉管細胞核和1個生殖細胞核，每個生殖細胞核再進行一次有絲分裂生成2個精子。BD第三十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)知識-----產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑途徑一：花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植株；途徑二：花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將其誘導(dǎo)分化成植株。人工種子是由外植體通過組織培養(yǎng)而獲得的胚狀體，然后加上人造胚乳，人造種皮而制成；外植體進行的是有絲分裂，無須通過兩性生殖細胞結(jié)合而發(fā)育成的個體，屬于無性生殖。第三十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)知識------影響花藥培養(yǎng)的因素1、主要的影響因素：材料的選擇與培養(yǎng)基的組成。（1）接種的花藥時期：一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側(cè)時，花藥培養(yǎng)成功率最高。選擇完全未開放的花蕾，可挑選到單核期的花藥，菌少、易消毒；花瓣松動，菌多，消毒困難。（2）此外，親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度對誘導(dǎo)成功率都有一定的影響。第三十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一一、材料的選取1、選擇花藥一般通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。2、確定花粉發(fā)育時期最常用方法：醋酸洋紅法；焙花青－鉻礬法。注：花粉細胞核內(nèi)有染色體，染色體主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，醋酸洋紅為堿性染色劑，染色體容易被染色。通過染色，可以確定細胞核為單核期還是雙核期，是單核居中期還是單核靠邊期。一般單核靠邊期的花藥培養(yǎng)成功率最高。二、材料的消毒三、接種和培養(yǎng)實驗操作第三十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期一四、結(jié)果分析與評價1、能夠通過鏡檢找到處于適宜的發(fā)育期的花粉。用醋酸洋紅法或焙花青－鉻礬法檢測單核靠邊期的花粉粒。2、花藥出現(xiàn)污染的原因：（1）消毒不徹底；（2）接種室污染；（3）人為因素的交叉污染等。