微生物檢驗(yàn)技術(shù)講授:周慧恒第一頁(yè)，共273頁(yè)。一、第一講二、第二講三、第三講四、第四講五、第五講六、第六講七、第七講八、第八講九、第九講十、第十講目錄一、實(shí)訓(xùn)一二、實(shí)訓(xùn)二三、實(shí)訓(xùn)三四、實(shí)訓(xùn)四五、實(shí)訓(xùn)五六、實(shí)訓(xùn)六七、實(shí)訓(xùn)七八、實(shí)訓(xùn)八實(shí)訓(xùn)第二頁(yè)，共273頁(yè)。第一講：微生物及微生物檢驗(yàn)概述1、什么是微生物釀酒、天花，列文虎克、巴斯德、科赫第三頁(yè)，共273頁(yè)。遠(yuǎn)古人類(lèi)發(fā)現(xiàn)，吃剩的米粥數(shù)日后變成了醇香可口的飲料—人類(lèi)最早發(fā)明的酒第四頁(yè)，共273頁(yè)。天花是感染痘病毒引起的，無(wú)藥可治，每4名天花病人當(dāng)中便有一人死亡，而剩余的3人卻要留下丑陋的痘痕。明代以后，人痘接種法盛行起來(lái)。到目前為止，天花是在在世界范圍被人類(lèi)消滅或控制的第一個(gè)傳染病。天花病毒第五頁(yè)，共273頁(yè)。安東·列文虎克荷蘭格拉夫霍霍夫利特微生物的鼻祖

無(wú)孔不入的微生物，何時(shí)何地不在與人們打交道。甚至在我們體內(nèi)到處安營(yíng)扎寨，自由出入。可是，人們不肉眼看見(jiàn)它們，因而幾千年來(lái)，人類(lèi)竟不知道世界上還有微生物這東西存在。直到1673年列文虎克用自制顯微鏡發(fā)現(xiàn)了“小動(dòng)物”的微生物世界！他一生當(dāng)中磨制500多個(gè)鏡片，制造400多種顯微鏡，其中只有9種至今仍有人使用。雖然他活著的時(shí)候就看到人們承認(rèn)了他的發(fā)現(xiàn)，但要等到100多年以后，當(dāng)人們?cè)谟眯矢叩娘@微鏡重新觀察列文虎克描述的“小動(dòng)物”，并知道他們會(huì)引起人類(lèi)嚴(yán)重疾病和產(chǎn)生許多有用物質(zhì)時(shí)，才真正認(rèn)識(shí)到列文虎克對(duì)人類(lèi)認(rèn)識(shí)世界所作出的偉大貢獻(xiàn)。第六頁(yè)，共273頁(yè)。法國(guó)科學(xué)家路易斯·巴斯德(1822-1895)被后人譽(yù)為“微生物學(xué)之父”。證實(shí)發(fā)酵由微生物引起免疫學(xué)—預(yù)防接種鵝頸燒瓶實(shí)驗(yàn)也創(chuàng)造了一種有效的滅菌方法——巴氏滅菌法。

反駁微生物自然發(fā)生說(shuō)鵝頸燒瓶實(shí)驗(yàn)科學(xué)雖沒(méi)有國(guó)界，但科學(xué)家卻有自己的祖國(guó)德國(guó)的波恩大學(xué)普法戰(zhàn)爭(zhēng)爆發(fā)第七頁(yè)，共273頁(yè)。傳染病是人類(lèi)健康的大敵。從古至今，鼠疫、傷寒、霍亂、肺結(jié)核等許多可怕的病魔奪去了人類(lèi)無(wú)數(shù)的生命。人類(lèi)要戰(zhàn)勝這些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一個(gè)發(fā)現(xiàn)傳染病是由病原細(xì)菌感染造成的人就是羅伯特·科赫。

羅伯特·科赫（1843—1910）-德國(guó)醫(yī)學(xué)家羅伯特?？坪瞻l(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌一百周年被后人尊為細(xì)菌學(xué)鼻祖，傳染病的克星，細(xì)菌學(xué)的奠基人和開(kāi)拓者2003年，經(jīng)過(guò)全球10個(gè)國(guó)家的科學(xué)家的共同努力，終于確認(rèn)了冠狀病毒是SARS的病原體。最終判定這種冠狀病毒是否真正的元兇，依靠的是100多年前德國(guó)偉大的細(xì)菌學(xué)家科赫提出的“科赫原則”。1870結(jié)婚-1900年30歲生日-1910第八頁(yè)，共273頁(yè)。2、微生物的特點(diǎn)1.個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單2.分布廣，種類(lèi)多3.繁殖快，數(shù)量大4.易于變異，適應(yīng)力強(qiáng)5.易于培養(yǎng)，代謝活力強(qiáng)第九頁(yè)，共273頁(yè)。3、微生物對(duì)產(chǎn)品的污染食品中的微生物直接致病微生物相對(duì)致病微生物非致病微生物腐敗變質(zhì)特殊條件下致病食源性疾病或食物中毒第十頁(yè)，共273頁(yè)。直接致病微生物：致病性的細(xì)菌、人畜共患傳染病病原菌和病毒、產(chǎn)毒霉菌和霉菌毒素，可直接對(duì)人體致病和造成危害。沙門(mén)氏菌、痢疾桿菌、副溶血性弧菌、致病性大腸桿菌、肉毒梭菌等結(jié)核桿菌、布氏桿菌、炭疽桿菌第十一頁(yè)，共273頁(yè)。相對(duì)（條件）致病微生物通常條件下不致病，在一定特殊條件下才有致病力的微生物。葡萄球菌、鏈球菌、變形桿菌、蠟樣芽胞桿菌等貯存方式不當(dāng)人體抵抗力下降第十二頁(yè)，共273頁(yè)。非致病微生物對(duì)人體本身無(wú)害、是引起食品腐敗變質(zhì)、衛(wèi)生質(zhì)量下降的主要原因。因此又叫腐敗菌非致病菌、不產(chǎn)毒霉菌以及酵母假單胞菌屬、黃桿菌屬、產(chǎn)鹼桿菌屬、芽胞桿菌屬、梭狀芽胞桿菌。第十三頁(yè)，共273頁(yè)。4、污染的預(yù)防與控制第十四頁(yè)，共273頁(yè)。低溫保藏高溫保藏干燥腌制微生物食品pHaw第十五頁(yè)，共273頁(yè)。消毒--殺滅或清除傳播媒介上病原微生物，使其達(dá)到無(wú)害化的FF。滅菌--用物理和化學(xué)方法殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的方法。第十六頁(yè)，共273頁(yè)。

利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類(lèi)發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用。低溫通常起抑菌作用。

嗜冷微生物適合于－10℃生活的細(xì)菌，最適生長(zhǎng)溫度在20℃左右。嗜溫微生物生長(zhǎng)溫度在15～45℃之間，最適生長(zhǎng)溫度在37℃左右的細(xì)菌。

嗜熱微生物生長(zhǎng)溫度在30～75℃之間，最適生長(zhǎng)溫度在55℃，在100℃以上溫度生長(zhǎng)，稱為嗜高熱微生物。第十七頁(yè)，共273頁(yè)。消毒與滅菌方法a、干熱滅菌法

1.火焰滅菌（酒精燈）

2.干熱滅菌（電熱干燥箱）b、濕熱滅菌法

1.巴氏消毒

2.煮沸消毒

3.間歇滅菌法

4.加熱蒸汽滅菌法（高壓滅菌鍋）c、輻射d、過(guò)濾e、化學(xué)方法第十八頁(yè)，共273頁(yè)。5、微生物檢驗(yàn)的意義a、它是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)。b、通過(guò)食品微生物檢驗(yàn)，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生環(huán)境，能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度作出正確的評(píng)價(jià)。c、食品微生物檢驗(yàn)是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針。第十九頁(yè)，共273頁(yè)。6、微生物檢驗(yàn)的對(duì)象菌落總數(shù)大腸菌群第二十頁(yè)，共273頁(yè)。各種曲霉的菌落青霉的菌落第二十一頁(yè)，共273頁(yè)。啤酒酵母的菌落紅酵母的菌落各種酵母菌的菌落第二十二頁(yè)，共273頁(yè)。7、微生物檢驗(yàn)的質(zhì)量管理一)內(nèi)部質(zhì)量控制a.為保證實(shí)驗(yàn)室連續(xù)評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性和精密度，必須對(duì)所用方法的重復(fù)性及再現(xiàn)性定期測(cè)定b.對(duì)于不同的控制系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)室必須建立限值，超過(guò)限值應(yīng)采取糾偏措施。實(shí)踐中內(nèi)部質(zhì)量控制可包括：(1)系統(tǒng)地使用一式雙份的菌落計(jì)數(shù)測(cè)定；(2)由同一檢驗(yàn)人員和幾個(gè)檢驗(yàn)人員作平行樣；(3)定期或不定期進(jìn)行盲樣測(cè)試。第二十三頁(yè)，共273頁(yè)。（二)外部質(zhì)量控制a.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加外部的質(zhì)量控制活動(dòng),對(duì)其開(kāi)展的每一項(xiàng)檢測(cè)均應(yīng)參加相應(yīng)的室間質(zhì)量控制。b.對(duì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)室或管理機(jī)構(gòu)發(fā)出的測(cè)試樣品應(yīng)嚴(yán)格地當(dāng)作普通樣品一樣處理,這樣一種方法有助于實(shí)驗(yàn)室每天測(cè)試的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,是對(duì)實(shí)驗(yàn)室所用的方法,試劑,設(shè)備,人員能力的測(cè)試。第二十四頁(yè)，共273頁(yè)。C.從室間樣品測(cè)試中的錯(cuò)誤可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的不足之處,對(duì)工作人員的教育改進(jìn)可以提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量。d.對(duì)返回的室間測(cè)定評(píng)級(jí)中存在的問(wèn)題應(yīng)當(dāng)召集體員工討論,改進(jìn)措施(包括方法的改變,員工的改變,員工的再訓(xùn)練,培養(yǎng)基和試劑購(gòu)買(mǎi)來(lái)源的更換等)應(yīng)當(dāng)記錄在案。第二十五頁(yè)，共273頁(yè)。e.某些項(xiàng)目缺少室間質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室可以設(shè)置室內(nèi)質(zhì)量控制,每半年自行評(píng)估一次。f.經(jīng)常參加微生物實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)控活動(dòng),有助于加強(qiáng)檢測(cè)人員的基本功訓(xùn)練,增強(qiáng)樣品檢測(cè)過(guò)程中“量”的概念。g.實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)控可在國(guó)內(nèi)外范圍進(jìn)行,有能力的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)力爭(zhēng)參加國(guó)家際間質(zhì)控活動(dòng),樹(shù)立良好的檢驗(yàn)信譽(yù)。第二十六頁(yè)，共273頁(yè)。8、微生物檢驗(yàn)的發(fā)展趨勢(shì)近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和微電子技術(shù)的飛速發(fā)展，快速、準(zhǔn)確、特異檢驗(yàn)微生物的新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，微生物檢驗(yàn)技術(shù)由培養(yǎng)水平向分子水平邁進(jìn)，并向儀器化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展，提高了食品微生物檢驗(yàn)工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。第二十七頁(yè)，共273頁(yè)。1.電阻抗法電阻抗法是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于食品微生物的檢驗(yàn)。其原理是細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中，將會(huì)使培養(yǎng)基中的大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等，代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，如乳酸鹽、醋酸鹽等，這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基的電阻抗變化情況，判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖特性，即可檢測(cè)出相應(yīng)的細(xì)菌。該法目前已經(jīng)用于細(xì)菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等的檢測(cè)。第二十八頁(yè)，共273頁(yè)。2.快速酶觸反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測(cè)

快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成和釋放某些特異性的酶，根據(jù)酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助于細(xì)菌快速診斷。如美國(guó)3MPetfifilmTM微生物測(cè)試片可分別快速測(cè)定細(xì)菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸菌群等。第二十九頁(yè)，共273頁(yè)。3.微量生化法

Bachman和Weaver在20世紀(jì)40年代后期首先開(kāi)創(chuàng)了微量生化法。至今，市售的微生物鑒定用試劑盒有多種，常見(jiàn)的有MICRO-ID、API等。API由20個(gè)含干燥培養(yǎng)基的微管組成，其中的培養(yǎng)基用于進(jìn)行酶促反應(yīng)或糖發(fā)酵試驗(yàn)。檢驗(yàn)時(shí)將預(yù)處理的菌懸液加入微管中培養(yǎng)后觀察顏色變化，并紀(jì)錄，輸入APILABPlus軟件得出結(jié)果。API創(chuàng)建了獨(dú)特的數(shù)值鑒定法，可鑒定15個(gè)系列、600多個(gè)細(xì)菌種。因此，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、可靠等特點(diǎn)。第三十頁(yè)，共273頁(yè)。第二講:微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特性微生物非細(xì)胞生物細(xì)胞生物病毒原核生物真核生物細(xì)菌酵母菌、霉菌第三十一頁(yè)，共273頁(yè)。1、細(xì)菌細(xì)菌是一種具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞生物.細(xì)菌的大小以微米（μm）為測(cè)量單位（一微米等于千分之一毫米）。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)一般分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類(lèi)。細(xì)菌具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核糖體和內(nèi)含物等基本結(jié)構(gòu)。細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)有莢膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。第三十二頁(yè)，共273頁(yè)。大腸桿菌第三十三頁(yè)，共273頁(yè)。金黃色葡萄球菌第三十四頁(yè)，共273頁(yè)。第三十五頁(yè)，共273頁(yè)。第三十六頁(yè)，共273頁(yè)。2、酵母酵母菌（yeast）是一通俗名稱，沒(méi)有確切定義。一般認(rèn)為酵母菌具有以下五個(gè)特點(diǎn)：個(gè)體一般以單細(xì)胞狀態(tài)存在多數(shù)出芽繁殖，也有的裂殖能發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)能細(xì)胞壁常含有甘露聚糖喜在含糖量較高、酸度較大的環(huán)境中生長(zhǎng)酸度較大的環(huán)境中生長(zhǎng)第三十七頁(yè)，共273頁(yè)。第三十八頁(yè)，共273頁(yè)。種類(lèi)較多，目前已知100多個(gè)屬，有700多種。分布廣，在水果、蔬菜、花蜜和植物葉子表面以及果園的土壤里。在牛奶、動(dòng)物的排泄物以及空氣中也有酵母存在。大多數(shù)腐生，少數(shù)寄生。與人類(lèi)關(guān)系密切第三十九頁(yè)，共273頁(yè)。酵母菌是人類(lèi)應(yīng)用比較早的微生物。在食品方面——釀酒、制作面包、生產(chǎn)調(diào)味品等。在醫(yī)藥方面——生產(chǎn)酵母片、核糖核酸、核黃素、細(xì)胞色素C、B族維生素、乳糖酶、脂肪酶、氨基酸等。在化工方面——使石油脫臘、以石油為原料生產(chǎn)檸檬酸等。在農(nóng)業(yè)方面——生產(chǎn)飼料（例如單細(xì)胞蛋白SCP）。在生物工程方面——作為基因工程的受體菌。第四十頁(yè)，共273頁(yè)。3、霉菌指凡是在基質(zhì)上長(zhǎng)成絨毛狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀的絲狀真菌，其菌絲體比較發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型子實(shí)體。第四十一頁(yè)，共273頁(yè)。霉菌的菌落特征：液體培養(yǎng)時(shí)的特征：如果是靜止培養(yǎng)，菌絲往往在液體表面生長(zhǎng)，液面上形成菌膜。如果是震蕩培養(yǎng)，菌絲可相互纏繞在一起形成菌絲球，亦可形成絮片狀，與震蕩震蕩速度有關(guān)。菌落特征霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈絨毛狀、絮狀或網(wǎng)狀等，菌體可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長(zhǎng)，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈紅、黃、綠、青綠、青灰、黑、白、灰等多種顏色。第四十二頁(yè)，共273頁(yè)。常見(jiàn)的霉菌：Aspergillusflavus（黃曲霉）Asp.niger（黑曲霉）Mucormucedo（高大毛霉）Rhizopusoryzae（米根霉）Pencillinmchrysogenum（產(chǎn)黃曲霉）Neurosporacrassa（粗糙鐮孢霉）Trichodermaviride（綠色木霉）第四十三頁(yè)，共273頁(yè)。土曲霉的菌落第四十四頁(yè)，共273頁(yè)。黑根霉的菌落第四十五頁(yè)，共273頁(yè)。青霉的菌落第四十六頁(yè)，共273頁(yè)。黑曲霉的菌落第四十七頁(yè)，共273頁(yè)。5、病毒病毒的結(jié)構(gòu)十分簡(jiǎn)單，沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只有蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部的遺傳物質(zhì)。豌豆萎黃病毒煙草花葉病毒大腸桿菌噬菌體球狀桿狀蝌蚪狀第四十八頁(yè)，共273頁(yè)。123445第四十九頁(yè)，共273頁(yè)。病毒不能獨(dú)立生活，必須寄生在其他生物的細(xì)胞內(nèi)。一旦離開(kāi)活細(xì)胞，病毒的生命活動(dòng)就會(huì)停止。第五十頁(yè)，共273頁(yè)。6、微生物的營(yíng)養(yǎng)微生物同其他生物一樣都是具有生命的，微生物細(xì)胞直接同生活環(huán)境接觸并不停地從外界環(huán)境吸收適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)合成新的細(xì)胞物質(zhì)和貯藏物質(zhì)，并儲(chǔ)存能量，微生物從環(huán)境中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并加以利用的過(guò)程即稱為微生物的營(yíng)養(yǎng)（nutrition）。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是微生物構(gòu)成菌體細(xì)胞的基本原料，也是獲得能量以及維持其它代謝機(jī)能必須的物質(zhì)基礎(chǔ)。微生物吸收何種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)取決于微生物細(xì)胞的化學(xué)組成。第五十一頁(yè)，共273頁(yè)。分析微生物細(xì)胞的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)微生物細(xì)胞與其他生物細(xì)胞的化學(xué)組成并沒(méi)有本質(zhì)上的差異。第五十二頁(yè)，共273頁(yè)。7、微生物的生長(zhǎng)1.個(gè)體生長(zhǎng)很不明顯，持續(xù)很短時(shí)間就繁殖。2.在實(shí)際的工作中，常以微生物的群體為單位來(lái)研究微生物的生長(zhǎng)。第五十三頁(yè)，共273頁(yè)。調(diào)整期對(duì)數(shù)期衰亡期時(shí)間細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)穩(wěn)定期第五十四頁(yè)，共273頁(yè)。溫度A：微生物生長(zhǎng)最旺盛時(shí)的溫度叫最適生長(zhǎng)溫度B：絕大多數(shù)微生物最適生長(zhǎng)溫度為25℃--37℃C：最適溫度范圍內(nèi)，微生物的生長(zhǎng)速率隨溫度上升而加快；超過(guò)最適生長(zhǎng)溫度后，微生物的生長(zhǎng)速率急劇下降D：依據(jù)最適生長(zhǎng)溫度，可將微生物分為低溫型、高溫型、中溫型。第五十五頁(yè)，共273頁(yè)。氧依據(jù)對(duì)氧的需求，微生物分為好氧型微生物（多數(shù)細(xì)菌、大多數(shù)真菌）；厭氧型微生物（某些鏈球菌、某些產(chǎn)甲烷桿菌）；兼性厭氧型微生物（酵母菌）PHA：每種微生物的最適PH不同B：多數(shù)細(xì)菌最適PH是6.5—7.5；真菌5.0—6.0；放線菌7.5—8.5。C：超過(guò)最適PH，影響酶活性、細(xì)胞膜穩(wěn)定性等第五十六頁(yè)，共273頁(yè)。7、微生物的代謝微生物在生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖過(guò)程中，需要不斷地從外界環(huán)境中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列的生化反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成能量和構(gòu)成細(xì)胞的物質(zhì)，并排出不需要的產(chǎn)物。這一系列的生化過(guò)程稱為新陳代謝。微生物的代謝(metabolism)是指發(fā)生在微生物細(xì)胞中的分解代謝(catabolism)與合成代謝(anabolism)的總和。第五十七頁(yè)，共273頁(yè)。1、微生物實(shí)驗(yàn)室守則

微生物實(shí)驗(yàn)室守則包括以下幾個(gè)方面：人員、培養(yǎng)基、菌種、實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行、設(shè)備、文件、實(shí)驗(yàn)記錄、結(jié)果的判斷等。第三講:微生物常規(guī)技術(shù)與培養(yǎng)基

的配制第五十八頁(yè)，共273頁(yè)。

影響藥品微生物的檢驗(yàn)結(jié)果的因素。

a、實(shí)驗(yàn)人員在取樣或試驗(yàn)過(guò)程中污染微生微。b、生物學(xué)分析方法本身的誤差。

c、樣品中或環(huán)境中微生物分布不均勻等因素在藥品檢驗(yàn)中，為保證微生物試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和重現(xiàn)性，藥品微生物實(shí)驗(yàn)室必須使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測(cè)方法并按良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)試驗(yàn)。第五十九頁(yè)，共273頁(yè)。無(wú)菌室布局

無(wú)菌室應(yīng)遠(yuǎn)離交通干道、廁所及污染區(qū)，應(yīng)選上、下水道及其他安裝適宜的位置。無(wú)菌室的配套設(shè)施包括洗刷、培養(yǎng)基配制、消毒滅菌、滅菌物品存放和傳輸、培養(yǎng)間、結(jié)果觀察、試驗(yàn)菌實(shí)驗(yàn)和辦公室等，要集中，減少污染，便于管理和使用。

第六十頁(yè)，共273頁(yè)。第六十一頁(yè)，共273頁(yè)。2、培養(yǎng)基的配制定義：指由人工配制的、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，（混合養(yǎng)料）。特點(diǎn)：任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營(yíng)養(yǎng)要素（碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、能源、生長(zhǎng)因子、水），且應(yīng)比例適當(dāng)。所以一旦配成必須立即滅菌。用途：促使微生物生長(zhǎng)；積累代謝產(chǎn)物；分離微生物菌種；鑒定微生物種類(lèi)；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種保藏；制備微生物制品。因此，它是進(jìn)行科學(xué)研究，發(fā)酵生產(chǎn)微生物制品等的基礎(chǔ)第六十二頁(yè)，共273頁(yè)。原則：a.培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)（目的明確）b.營(yíng)養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)）c.物理化學(xué)條件適宜（條件適宜）d.根據(jù)培養(yǎng)目的選擇原料及其來(lái)源（經(jīng)濟(jì)節(jié)約）第六十三頁(yè)，共273頁(yè)。配料溶解調(diào)pH過(guò)濾分裝滅菌包扎擺斜面貯存步驟：第六十四頁(yè)，共273頁(yè)。第六十五頁(yè)，共273頁(yè)。（1）肉汁蛋白胨培養(yǎng)基------細(xì)菌牛肉膏5g，氯化納5g，蛋白胨10g，水1000ml，pH7.2-7.4（2）EC肉湯-------大腸桿菌胰蛋白胨20g，3號(hào)膽鹽(或混合膽鹽)

1.5g，乳糖5g，磷酸氫二鉀4g，磷酸二氫鉀1.5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL第六十六頁(yè)，共273頁(yè)。（3）麥芽汁培養(yǎng)基---------酵母菌干麥粉加4倍水，在60度保溫3—4h，用碘液試驗(yàn)至糖化完全為止，調(diào)糖度為100巴林，煮沸過(guò)濾，pH5-6.0（4）查氏培養(yǎng)基----------霉菌NaNO33g，F(xiàn)eSO40.01g，K2HPO4Ig，KCl0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，蔗糖30g，H2O1000ml，pH5--6

第六十七頁(yè)，共273頁(yè)。第六十八頁(yè)，共273頁(yè)。第六十九頁(yè)，共273頁(yè)。第七十頁(yè)，共273頁(yè)。3、消毒的基本概念與方法消毒是指采用物理、化學(xué)和生物的方法消除物體的表面病原菌和有害微生物的過(guò)程，使之達(dá)到無(wú)害化。消毒的保證水平為10-3，（指一件物體品經(jīng)消毒處理后仍然有微生物存在的機(jī)率）。滅菌

則是指指采用物理、化學(xué)和生物的方法殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體，芽孢和孢子的過(guò)程。要求的水平為10-6滅菌是絕對(duì)殺滅而不是相對(duì)，滅菌包含消毒但消毒不能包含滅菌。第七十一頁(yè)，共273頁(yè)。無(wú)菌經(jīng)滅菌處理后的物品稱為無(wú)菌物品無(wú)菌操作用于防止微生物進(jìn)入范圍的第七十二頁(yè)，共273頁(yè)。清潔消毒法第七十三頁(yè)，共273頁(yè)。清潔消毒法第七十四頁(yè)，共273頁(yè)。清潔消毒法第七十五頁(yè)，共273頁(yè)。第七十六頁(yè)，共273頁(yè)。消毒滅菌的級(jí)別①滅菌：——?dú)缫磺形⑸铮_(dá)到無(wú)菌。常用方法：高壓蒸汽、電離輻射、等離子體、二氧化氯、過(guò)氧乙酸、戊二醛等。

②高水平消毒可殺滅各種微生物，包含細(xì)菌芽孢。常用方法：熱力、紫外線、二氧化氯、臭氧。③中水平消毒可以殺滅和去除細(xì)菌芽孢以外的各種病原微生物的消毒方法。常用方法：超聲波、碘類(lèi)、醇類(lèi)、季銨鹽。④低水平消毒只能殺滅細(xì)菌繁殖體，親脂病毒的化學(xué)消毒方法。第七十七頁(yè)，共273頁(yè)。物理法

化學(xué)法浸泡法噴霧法熱力消毒法生物凈化法輻射消毒法燃燒法烤箱法煮沸法干熱法濕熱法紫外線燈照射法電子滅菌燈法電離輻射法擦拭法高壓蒸汽滅菌法常用消毒滅菌的方法熏蒸法日光曝曬法第七十八頁(yè)，共273頁(yè)。第四講：微生物檢驗(yàn)常規(guī)技術(shù)1、微生物染色及顯微形態(tài)觀察技術(shù)★細(xì)菌個(gè)體微小，且較透明，必須借助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明的對(duì)比，以便在顯微鏡下進(jìn)行觀察?！锔鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌煞譃楹?jiǎn)單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等?！锖?jiǎn)單染色法是最基本的染色方法，是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。第七十九頁(yè)，共273頁(yè)。第八十頁(yè)，共273頁(yè)。a.常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)其分子的染色部份帶正電荷，易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。第八十一頁(yè)，共273頁(yè)。一）、涂片：——無(wú)菌操作——滴的生理鹽水的量不能太多——菌不能加太多，涂布要均勻第八十二頁(yè)，共273頁(yè)。二）、干燥和固定三）、染色四）、水洗五）、干燥：不能擦第八十三頁(yè)，共273頁(yè)。六）、鏡檢——必須完全干燥后才能用油鏡觀察★油鏡使用原理及注意事項(xiàng)第八十四頁(yè)，共273頁(yè)。油鏡操作步驟1、低倍鏡觀察（尋找觀察目標(biāo)）。2、高倍鏡觀察（選取理想的觀察目標(biāo)）。3、油鏡觀察：高倍鏡觀察后-上升鏡筒-油鏡轉(zhuǎn)至正下方，在載玻片上加一小滴油-小心地下降鏡筒使鏡頭浸在油里-用粗螺旋將鏡筒緩慢上升，尋找目標(biāo)（物象）用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)，使物象清晰-觀察記錄。最大光圈第八十五頁(yè)，共273頁(yè)。4、觀察完畢。上升鏡筒，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡物鏡偏位。用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上的油跡，再取一張擦鏡紙醮上二甲苯擦去鏡頭上殘留的香柏油，最后再用一張干凈的擦鏡紙擦去殘留在鏡頭上的二甲苯。5、將顯微鏡各部分還原，放回箱中。第八十六頁(yè)，共273頁(yè)。b.格蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的重要鑒別染色法，通過(guò)此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類(lèi)。革蘭氏染色過(guò)程所用四種不同溶液的作用：（1）堿性染料

草酸銨結(jié)晶紫液。（2）媒染劑

碘液，其作用是增強(qiáng)染料與菌體的親和力，加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合。（3）脫色劑

乙醇將染料溶解，使被染色的細(xì)胞脫色。利用不同細(xì)菌對(duì)染料脫色的難易程度不同，而加以區(qū)分。（4）復(fù)染液

蕃紅溶液，目的是使經(jīng)脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進(jìn)行比較。第八十七頁(yè)，共273頁(yè)。操作步驟（1）涂片

取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌制成涂片，干燥、固定。要求單一菌種、混合涂片（在載玻片同一區(qū)域用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合涂片）各制一片。（2）染色

用草酸銨結(jié)晶紫染液染色1min，用水沖洗。（3）媒染

滴加革蘭氏碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋1min，水沖去碘液。（4）乙醇脫色

以95%乙醇脫色20~30s。立即用水沖洗凈乙醇并用濾紙輕輕吸干。脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格掌握乙醇的脫色程度。若脫色過(guò)度則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌；若脫色不夠則陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。第八十八頁(yè)，共273頁(yè)。（5）復(fù)染

蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。（6）吸干并鏡檢

若研究工作中要確證未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，則需同時(shí)用已知菌進(jìn)行染色作為對(duì)照。第八十九頁(yè)，共273頁(yè)。2、微生物的計(jì)數(shù)技術(shù)直接計(jì)數(shù)核酸計(jì)數(shù)培養(yǎng)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)比濁法電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法熒光定量PCR最大可能數(shù)法混菌法平板計(jì)數(shù)法第九十頁(yè)，共273頁(yè)。平板計(jì)數(shù)法

使不可見(jiàn)的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)成為可見(jiàn)的菌落（CFU），從而可用肉眼進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)。較其他方法直觀準(zhǔn)確，是一種經(jīng)典的檢測(cè)活菌數(shù)的方法，也是目前國(guó)際上通用的方法。第九十一頁(yè)，共273頁(yè)。平板計(jì)數(shù)法示意圖第九十二頁(yè)，共273頁(yè)。第九十三頁(yè)，共273頁(yè)。平板計(jì)數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、準(zhǔn)確、可靠該方法不僅可以檢測(cè)到樣品中的有效活菌數(shù)，而且可以檢測(cè)到產(chǎn)品的微生物污染情況，即雜菌數(shù)。缺點(diǎn)：由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得的結(jié)果一般低于實(shí)際值。第九十四頁(yè)，共273頁(yè)。操作步驟（一）檢測(cè)前的準(zhǔn)備（二）操作過(guò)程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識(shí)別、計(jì)數(shù)）（三）計(jì)算第九十五頁(yè)，共273頁(yè)。稀釋、加樣和涂布注意事項(xiàng)適宜稀釋度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)提供的信息選擇稀釋度。系列稀釋時(shí)不同的稀釋度應(yīng)更換吸管（移液管），加樣和涂布不同稀釋度時(shí)也要更換吸管和刮刀。每個(gè)培養(yǎng)皿均要標(biāo)明培養(yǎng)基種類(lèi)、樣品編號(hào)、稀釋度稀釋和加樣要準(zhǔn)確，涂布均勻及時(shí)，使用的吸管量程要適宜。無(wú)菌水對(duì)照，以檢查吸管、刮刀以及稀釋用水滅菌是否徹底、操作過(guò)程是否合乎無(wú)菌要求。第九十六頁(yè)，共273頁(yè)。3、菌種保藏技術(shù)菌種是進(jìn)行微生物學(xué)研究和應(yīng)用的基本材料。微生物保存不妥容易發(fā)生變異，或被其他微生物污染，甚至導(dǎo)致微生物死亡。菌種的長(zhǎng)期保藏是非常必要的。菌種保藏要求具有該菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。第九十七頁(yè)，共273頁(yè)?；驹硎窃谔暨x優(yōu)良純培養(yǎng)物并使新陳代謝處于最低或幾乎停止的狀態(tài)，即使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境，使其長(zhǎng)期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性?；敬胧┦堑蜏?、真空、干燥。第九十八頁(yè)，共273頁(yè)。常用保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法-80℃低溫凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法第九十九頁(yè)，共273頁(yè)。第5講微生物檢驗(yàn)工作流程與質(zhì)量控制1、微生物檢驗(yàn)工作流程a.送檢樣品的處理樣品的接收①樣品數(shù)量的多少，其包裝是否完好，樣品溫度是否變化。②干燥的樣品有無(wú)受潮現(xiàn)象，冷凍樣品是否融化，易腐樣品有無(wú)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。③采樣記錄。第一百頁(yè)，共273頁(yè)。b.樣品登記

注明柜號(hào)、品名、客戶、采樣日期/時(shí)間、采樣人、追蹤編號(hào)（半成品）等。第一百零一頁(yè)，共273頁(yè)。試劑準(zhǔn)備

準(zhǔn)備檢驗(yàn)項(xiàng)目用的所有藥品試劑，并放入傳遞窗。c.檢驗(yàn)前準(zhǔn)備工作第一百零二頁(yè)，共273頁(yè)。藥品稱量及溶解第一百零三頁(yè)，共273頁(yè)。藥品分裝第一百零四頁(yè)，共273頁(yè)。包扎、滅菌及驗(yàn)證第一百零五頁(yè)，共273頁(yè)。平皿、吸管的包扎第一百零六頁(yè)，共273頁(yè)。干燥滅菌第一百零七頁(yè)，共273頁(yè)。更換工作服在第一緩沖間內(nèi)更換專(zhuān)用工作服，并戴口罩、內(nèi)帽、鞋套。消毒處理第一百零八頁(yè)，共273頁(yè)。取樣

取樣時(shí)，對(duì)樣品袋口用75%酒精噴灑消毒，用無(wú)菌器具（鑷子、剪刀、小勺）進(jìn)行取樣。d.樣品檢驗(yàn)第一百零九頁(yè)，共273頁(yè)。做樣

菌落總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、霉菌/酵母菌的具體檢驗(yàn)根據(jù)檢驗(yàn)規(guī)程操作。第一百一十頁(yè)，共273頁(yè)。培養(yǎng)操作完成后，放進(jìn)適宜溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。（例如，LST在36±1℃培養(yǎng)48h，BPW在37℃水浴培養(yǎng)18h等）第一百一十一頁(yè)，共273頁(yè)。洗涮及晾干第一百一十二頁(yè)，共273頁(yè)。e.結(jié)果報(bào)告第一百一十三頁(yè)，共273頁(yè)。2、微生物檢測(cè)的質(zhì)量控制1檢驗(yàn)人員2儀器.設(shè)備3檢驗(yàn)培養(yǎng)基,試劑4檢驗(yàn)環(huán)境5采樣6樣品的接收和預(yù)處理7檢驗(yàn)質(zhì)量8校驗(yàn)的執(zhí)行9參考菌株及其保存10實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外部質(zhì)量控制11檢驗(yàn)報(bào)告及結(jié)果質(zhì)量控制第一百一十四頁(yè)，共273頁(yè)。1檢驗(yàn)人員(1)微生物檢驗(yàn)不能完全依賴全自動(dòng)鑒定儀器,檢驗(yàn)工作中每一步驟均需要有高度的主觀分析和判斷能力,與個(gè)人的經(jīng)驗(yàn).技能和微生物檢驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)水平密切相關(guān).(2)除要求微生物檢驗(yàn)人員必須具備嚴(yán)肅認(rèn)真的工作態(tài)度,精密細(xì)致的觀察和操作習(xí)慣,注重個(gè)人衛(wèi)生外,還必須訓(xùn)練掌握微生物檢驗(yàn)技術(shù).(3)檢驗(yàn)人員應(yīng)執(zhí)行上崗前培訓(xùn)制度,上崗前培訓(xùn)合格方能上崗操作,還要主動(dòng)參加學(xué)習(xí),培訓(xùn),講座,學(xué)習(xí)新技術(shù),掌握微生物學(xué)檢驗(yàn)方法,標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律法規(guī)第一百一十五頁(yè)，共273頁(yè)。(4)參與編寫(xiě)測(cè)試程序及儀器操作程序,學(xué)習(xí)質(zhì)量保證體系知識(shí)和計(jì)量學(xué)基本知識(shí)(5)參加各類(lèi)水平測(cè)試和盲樣測(cè)試,提高檢測(cè)水平和分析問(wèn)題,解決問(wèn)題的能力(6)微生物學(xué)檢驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)定期對(duì)檢驗(yàn)人員進(jìn)行專(zhuān)業(yè)知識(shí)和操作熟練程度的考核,提高檢驗(yàn)人員的素質(zhì).第一百一十六頁(yè)，共273頁(yè)。3培養(yǎng)基為保證干粉培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)，在實(shí)際工作中應(yīng)注意；（1）加強(qiáng)包裝的密封性能；（2）使用時(shí)盡量縮短開(kāi)蓋時(shí)間；（3）一般干性培養(yǎng)基放在低溫干燥的環(huán)境中保存，對(duì)于易受潮的品種，啟用后宜放入干燥器中保存；（4）由于配制水分不同，啟用次數(shù)或時(shí)間增加，干粉培養(yǎng)基的pH值可能會(huì)有所變化，應(yīng)隨時(shí)略加調(diào)整。第一百一十七頁(yè)，共273頁(yè)。培養(yǎng)基的配制應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行操作，并做好原始記錄。為保證培養(yǎng)基必須在玻璃容器，搪瓷或鋁鍋中進(jìn)行，如用銅，鐵器皿，會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)有毒害作用；配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)按檢驗(yàn)項(xiàng)目規(guī)定的配方添加，不得隨意增減或更改培養(yǎng)基成分。此外，要用專(zhuān)用的角匙取藥品，避免交叉污染而影響檢驗(yàn)結(jié)果；第一百一十八頁(yè)，共273頁(yè)。培養(yǎng)基配制最好用蒸餾水或去離子水，避免使用自來(lái)水，因其中含有氯等抗菌物質(zhì)；不同類(lèi)型的微生物對(duì)pH值的要求不同，配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)測(cè)調(diào)值，如測(cè)定結(jié)果與所要求的值不符，則用1NNaOH或1NHCL溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。第一百一十九頁(yè)，共273頁(yè)。7檢驗(yàn)質(zhì)量除按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)所需檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)外，在實(shí)際工作中還應(yīng)注意以下幾個(gè)方面，否則會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性：（1）在定量檢驗(yàn)時(shí)用重量法還是用體積法，檢驗(yàn)結(jié)果會(huì)有誤差，因?yàn)榇酥夭坏扔?的樣品，1ml和1g的化驗(yàn)結(jié)果絕不會(huì)相等.一般固態(tài)的樣品宜用重量法,液體樣品宜用體積法.但對(duì)粘性液體(如酸奶),如用體積法,會(huì)粘附一定量的樣品在吸管上,因此此類(lèi)樣品最好用重量法.第一百二十頁(yè)，共273頁(yè)。(2)如檢樣需用用無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水稀釋,則最好用均質(zhì)器或組織碎機(jī),以8000`10000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速處理1min,制成均勻的菌懸液.(3)樣品稀釋時(shí),常會(huì)滯留少量樣品在吸管內(nèi)外,應(yīng)多加注意.吸入液體后,應(yīng)沿管壁慢慢注入遞增的稀釋中,特別注意此時(shí)吸管尖端切不可碰到稀釋液中.第一百二十一頁(yè)，共273頁(yè)。(4)在培養(yǎng)基注入檢樣,菌懸液時(shí),注意培養(yǎng)基溫度宜在45℃

-50℃

之間,并使培養(yǎng)基與檢樣,菌懸液充分混合.(5)微生物培養(yǎng)時(shí),應(yīng)根據(jù)要求選擇正確的培養(yǎng)溫度和時(shí)間.(6)應(yīng)用無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照,如果在空白對(duì)照中檢出細(xì)菌,則可認(rèn)為培養(yǎng)基質(zhì)量存在問(wèn)題或在操作過(guò)程中存在污染情況.另外,采用標(biāo)準(zhǔn)菌種作陽(yáng)性對(duì)照,觀察培養(yǎng)基的質(zhì)量情況.(7)整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作.(8)及時(shí)檢查結(jié)果,做好原始數(shù)據(jù)記錄.第一百二十二頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十三頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十四頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十五頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十六頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十七頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十八頁(yè)，共273頁(yè)。第一百二十九頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十一頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十二頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十三頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十四頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十五頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十六頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十七頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十八頁(yè)，共273頁(yè)。第一百三十九頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十一頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十二頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十三頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十四頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十五頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十六頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十七頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十八頁(yè)，共273頁(yè)。第一百四十九頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十一頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十二頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十三頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十四頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十五頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十六頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十七頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十八頁(yè)，共273頁(yè)。第一百五十九頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十一頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十二頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十三頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十四頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十五頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十六頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十七頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十八頁(yè)，共273頁(yè)。第一百六十九頁(yè)，