蛋白質(zhì)的分離純化一，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取大部份蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采納不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一） 水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、 pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、 鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二） 有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的必然的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必需在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶專門優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，專門是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為％）可不能引發(fā)酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方式很多，要緊有：（一）依照蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方式一、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。二、等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。（二）依照蛋白質(zhì)分子大小的不同的分離方式一、 透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。二、 凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexged）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。依照蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。一、 電泳法各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。二、 離子互換層析法離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑(如：羧甲基纖維素；CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONTFACE="宋體〃LANG="ZH-CN"＞纖維素)，當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(詳見層析技術(shù)章)依照配體特異性的分離方式一親和色譜法親和層析法(aflinitychromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方式，它常常只需通過一步處置即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方式是依照某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其大體原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離(Separation)，提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparationzhaott提供蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的不同專門大，既或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不同，利用方式不同也專門大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部份大體手腕仍是一起的，大部份蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采納不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)和酶。蛋白質(zhì)與酶在不同溶劑中溶解度的不同，要緊取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，第二取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解不同的內(nèi)因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是阻礙蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。提取蛋白質(zhì)時(shí)常依照這些內(nèi)外因素綜合加以利用。將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來。并與其它不需要的物質(zhì)分開。但動(dòng)物材料中的蛋白質(zhì)有些可溶性的形式存在于體液(如血漿、消化硫等)中，能夠沒必要通過提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類和其他可溶性蛋白質(zhì)，最后剩下的確實(shí)是不溶性蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質(zhì)的抽提。若是抽提物的pH用適當(dāng)緩沖液操縱時(shí)，共穩(wěn)固性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷(Digitonin)溶液或有機(jī)溶劑來抽提。其它不溶于水的蛋白質(zhì)通經(jīng)常使用稀堿溶液抽提。一、蛋白質(zhì)類別溶解性質(zhì)的介紹簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)：白蛋白球蛋白：溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。真球蛋白：一樣在等電點(diǎn)時(shí)不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿那么可溶解。擬球蛋白：溶于水，可為50%飽和度硫酸銨析出醇溶蛋白：溶于70?80%乙醇中，不溶于水及無(wú)水乙醇?xì)さ鞍祝涸诘入婞c(diǎn)不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質(zhì)：不溶于水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白：包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等。此類蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)隨蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)結(jié)合部份的不同而異，除脂蛋白外，一樣可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部份露于外，那么脂溶性占優(yōu)勢(shì)，如脂肪部份被包圍于分子當(dāng)中，那么水溶性占優(yōu)勢(shì)。［整理日期］:2003—12—25104-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation二、蛋白質(zhì)提取與制備概述蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識(shí)很廣。最近幾年來雖有了很多改良，但其要緊原理仍不外乎兩個(gè)方面：一是利用混合物中幾個(gè)組分分派率的差別，把它們分派于可用機(jī)械方式分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分派于不同區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。由^蛋白質(zhì)不能溶化，也不能蒸發(fā)，所能分派的物相只限于固相和液相，并在這兩相間相互交替進(jìn)行分離純化。制備方式可依照分子大小、形狀、帶電性質(zhì)及溶解度等要緊因素進(jìn)行分類。按分子大小和形態(tài)分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方式；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分派層析、逆流分派及結(jié)晶等方式；按電荷不同分為電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、離子互換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。由于不同生物大分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同，分離方式也不一樣。即同一類生物大分子由于選用材料不同，利用方式不同也專門大。因此很難有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的方式對(duì)任何蛋白質(zhì)都可循用。因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行充分調(diào)查研究，查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)欲分離提純物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)先有必然了解，然后再著手進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作。關(guān)于一個(gè)未知結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的試樣進(jìn)行制造性的分離提純時(shí)，更需要通過各類方式比較和試探，才能找到一些工作規(guī)律和取得預(yù)期結(jié)果。第二在分離提純工作前，常須成立相應(yīng)的分析鑒定方式，以正確指導(dǎo)整個(gè)分離純化工作的順利進(jìn)行。高度提純某一生物大分子，一樣要通過量種方式、步驟及不斷變換各類外界條件才能達(dá)到目的。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程方式的好壞，選擇條件成效的好壞，均須通過分析鑒定來判明。另一方面，蛋白質(zhì)常以與其他生物體物質(zhì)結(jié)合形式存在，因此也易與這些物質(zhì)結(jié)合，這給分離精制帶來了困難。如極微量的金屬和糖對(duì)龐大蛋白質(zhì)的穩(wěn)固性起決定作用，假設(shè)被除去那么不穩(wěn)固的蛋白質(zhì)結(jié)晶化的難度也隨之增加。如頂峰淀粉酶A的Ca2+，胰島素Zn2+等。此外，高分子蛋白質(zhì)具有必然的立體構(gòu)象，相當(dāng)不穩(wěn)固，如前所述極易變性、變構(gòu)，因此限制了分離精制的方式。一般是依照具體對(duì)象聯(lián)用各類方式。為取得天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，盡可能米用溫和的手腕，如中性、低溫、幸免起泡等，并還要注意防腐。注意共存成份的阻礙。如蝮蛇粗毒的蛋白質(zhì)水解酶活性很高，在分離純化中需引發(fā)重視。純化蝮蛇神經(jīng)毒素時(shí)，當(dāng)室溫超過20°C時(shí)，幾乎得不到神經(jīng)毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被LEDTA完全抑制，因此在進(jìn)行柱層析前先將粗毒素LEDTA溶液處置，即便在室溫高于20C，仍能專門好的取得神經(jīng)毒素。整個(gè)制備進(jìn)程一樣可分為5個(gè)時(shí)期：①材料的選擇和預(yù)處置，②細(xì)胞的破碎（有時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞器的分離），③提取，④純化（包括鹽析，有機(jī)溶劑沉淀，有機(jī)溶劑提取、吸附、層析、超離心及結(jié)晶等），⑤濃縮、干燥及保留。以上5個(gè)時(shí)期不是要求每一個(gè)方案都完整地具備，也不是每一時(shí)期截然分開。不論是哪一時(shí)期利用哪一種方式，均必需在操作中保留生物大分子結(jié)構(gòu)的完整性。保留活性避免變性及降解現(xiàn)象的發(fā)生。因空間結(jié)構(gòu)要緊依托氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在，遇酸、遇堿、高溫、猛烈的機(jī)械作用及強(qiáng)烈的輻射等都可致使活性喪失。因此選擇的條件應(yīng)為十分溫和。同時(shí)應(yīng)注意避免系統(tǒng)中重金屬離子、細(xì)胞自身酶系及其他有毒物質(zhì)的污染。三、蛋白質(zhì)提取與制備具體操作方式1、原料的選擇早年為了研究的方便，盡可能尋覓含某種蛋白質(zhì)豐碩的器官?gòu)闹刑崛〉鞍踪|(zhì)。但至目前經(jīng)常碰到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細(xì)胞膜或內(nèi)膜等原材料，-105-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation因此對(duì)提取要求更復(fù)雜一些。原料的選擇要緊依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來源豐碩及成本低的原料。盡可能要新鮮原料。但有時(shí)這幾方面不同時(shí)具有。含量豐碩但來源困難，或含量來源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于取得純品者。一樣要注意種屬的關(guān)系，如鰹的心肌細(xì)胞色素C較馬的易結(jié)晶，馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。要事前調(diào)查制備的難易情形。假設(shè)利用蛋白質(zhì)的活性，對(duì)原料的種屬應(yīng)幾乎無(wú)阻礙。如利用胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性，用豬或牛胰臟都可。但假設(shè)研究蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)時(shí)，原料的來源種屬必需必然。研究由于病態(tài)引發(fā)的特殊蛋白質(zhì)（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白）時(shí)，不但利用種屬必然的原料，而且要取自同一個(gè)體的原料?？赡軙r(shí)盡可能用全年都可采到的原料。對(duì)動(dòng)物生理狀態(tài)間的不同（如饑餓時(shí)脂肪和糖類相對(duì)減少），采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。2、前處置a、細(xì)胞的破碎材料選定通常要進(jìn)行處置。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能當(dāng)即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)冷凍保留。除提取及胞細(xì)外成份，對(duì)細(xì)胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的分離提取均須先將細(xì)胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細(xì)胞破壞難易不一，利用方式也不完全相同。如動(dòng)物胰、肝、腦組織一樣較柔軟，作一般勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預(yù)先絞碎再制成勻槳。⑴機(jī)械方式要緊通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。經(jīng)常使用器械有：①高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片），宜用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面彼此摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對(duì)細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對(duì)分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。但在磨細(xì)時(shí)局部往往生熱致使變性或pH顯著轉(zhuǎn)變，尤其用玻璃粉和氧化鋁時(shí)。磨細(xì)劑的吸附也可致使損失。⑵物理方式要緊通過各類物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方式。I反復(fù)凍融法于冷藏庫(kù)或干冰反復(fù)于零下15?20°C使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部份細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的轉(zhuǎn)變，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。II冷熱變替法將材料投入滾水中，于90C左右維持?jǐn)?shù)分鐘，當(dāng)即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。III超聲波法暴露于9?10千周聲波或10?500千周超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)，只要有設(shè)備該法方便且成效也好，但一次處置量較小。應(yīng)用超聲波處置時(shí)應(yīng)注意幸免溶液中氣泡的存在。處置一些超聲波靈敏的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。W加壓破碎法加必然氣壓或水壓也可使細(xì)胞破碎。⑶化學(xué)及生物化學(xué)方式I有機(jī)溶媒法粉碎后的新鮮材料在0°C以下加入5?10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一樣不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，106-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保留數(shù)月不失去活性。II自溶法將待破碎的鮮材料在必然pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。比較穩(wěn)固，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時(shí)需要時(shí)刻，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)避免細(xì)菌污染。于溫室30C左右較早溶化。自體融解進(jìn)程中PH顯著轉(zhuǎn)變，隨時(shí)要調(diào)劑?日。自溶溫度選在0?4們因自溶時(shí)刻較長(zhǎng)，不易操縱，因此制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。m酶法與前述的自體融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。但值得提出的是溶菌酶處置時(shí)，它能水解組成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶散布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。ig菌體加1?10mg溶菌酶，?內(nèi)完全溶菌。于生理食鹽水或蔗糖溶液中溶菌，雖失去細(xì)胞膜，但原形質(zhì)沒有脫出。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細(xì)菌及植物細(xì)胞用。表面活性劑處置較經(jīng)常使用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基毗淀及去氧膽酸鈉等。另外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。b、細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采納細(xì)胞中某一部份的材料，或?yàn)榱思兓骋惶囟?xì)胞器上的生物大分子，避免其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，關(guān)于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其最近幾年來分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、遺傳工程等學(xué)科和技術(shù)的進(jìn)展，對(duì)散布在各類細(xì)胞器上的核酸和蛋白質(zhì)的研究工作日趨增多，分離各類細(xì)胞器上的各類核酸和特異性蛋白質(zhì)已成為生物大分子制備工作重要內(nèi)容之一。各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的散布是不同的。DNA幾乎全數(shù)集中在細(xì)胞核內(nèi)。RNA那么大部份散布于細(xì)胞質(zhì)。各類酶在細(xì)胞內(nèi)散布也有必然位置。因此制備細(xì)胞器上的生物大分子時(shí)，預(yù)先須對(duì)整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)散布匹有所了解。以肝細(xì)胞為例整理如表1表1蛋白質(zhì)、酶及核酸在肝細(xì)胞內(nèi)散布情形細(xì)胞器名稱要緊蛋白質(zhì)及酶類核酸類細(xì)胞核精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系RNA占總量10%左右DNA幾乎全數(shù)粒線體電子傳遞、氯化磷酸化、三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶系RNA占總量5%左右DNA微量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)（微粒體）蛋白質(zhì)合成酶系、羥化酶系RNA占總量50%左右溶酶體水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、組織蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）高爾基氏體糖苷轉(zhuǎn)移酶、粘多糖及類固醇合成酶系細(xì)胞膜載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP酶、環(huán)化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶等細(xì)胞液嘧啶和嘌吟代謝、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白類RNA（要緊為tRNA）占總量30%-107-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation細(xì)胞器的分離一樣采納差速離心法。細(xì)胞通過破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細(xì)胞器的分離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。最先利用的介質(zhì)是生理鹽水。因它容易使亞細(xì)胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀，沉淀分離成效不睬想，現(xiàn)一樣改用蔗糖、Ficoll(一種蔗糖多聚物)或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提?。捍蟛糠莸鞍踪|(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一樣以水為主。稀鹽溶液緩和沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)固性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最經(jīng)常使用溶劑。鹽溶液提取：以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)進(jìn)常注意下面幾個(gè)因素。鹽濃度等滲鹽溶液尤以?L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液經(jīng)常使用。L氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用L碳酸氫鈉液提取等。有時(shí)為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，也常利用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L以上氯化鈉液提取?？傊?，只要能溶解在水溶液中而與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的蛋白質(zhì)和酶，細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及PH，一樣是不難提取的。只有某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的，需采用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處置等方式提取。PH值：蛋白質(zhì)提取液的PH值第一應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)固的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)雙側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)那么選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取成效。如細(xì)胞色素C屬堿性蛋白質(zhì)，經(jīng)常使用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取。某些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇PH3?6范圍關(guān)于分離提取是有利的。溫度：多數(shù)酶的提取溫度在5°C以下。少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37?50C條件下提取，成效比低溫提取更好。另外提取酶時(shí)加入底物或輔酶，改變酶分子表面電荷散布，也能增進(jìn)提取成效。有機(jī)溶劑提取：有機(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。但一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。從一些粒線體(Mitochondria)及微粒體(Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時(shí)，采納Morton的丁醇法成效較好。因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣（pH3?10，溫度-2°C至40°C）。國(guó)內(nèi)用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。108-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation丁醇法對(duì)提取堿性磷酸脂酶成效也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取成效最好，一方面可抑制蛋白質(zhì)水解酶對(duì)胰島素的破壞，同時(shí)也達(dá)到大量除去雜蛋白的目的。表面活性劑的利用：關(guān)于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶，也有采納表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處置。表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽(yáng)離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（TritonX-100、TirtonX-114、吐溫60及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引發(fā)酶失活，利用較多。關(guān)于膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和結(jié)構(gòu)，己普遍采納膽酸鹽處置，兩者形成復(fù)合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。最近幾年來研究膜蛋白利用表面活性劑的稀溶液提取時(shí)，較喜愛用非離子型表面活性劑。對(duì)提取物的愛惜：在各類細(xì)胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時(shí)要注意避免由它引發(fā)的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是避免蛋白水解酶的水解。多數(shù)蛋白水解酶的最適PH在3?5或更高些，因在較低PH條件下可降低蛋白質(zhì)水解酶引發(fā)的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取進(jìn)程中不致激活而保留在酶原狀態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。加蛋白質(zhì)水解酶的抑制劑也一樣起愛惜作用，如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以巰基為中心的酶加對(duì)氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機(jī)溶劑時(shí)也能產(chǎn)生相類似的作用。蛋白水解酶的性質(zhì)轉(zhuǎn)變專門大，上述條件均視具體對(duì)象而轉(zhuǎn)變。有一些蛋白含巰基，這些巰基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA，后者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質(zhì)帶一些非共價(jià)鍵結(jié)合的配基。提取時(shí)要注意愛惜，不要使酸基丟失。四、蛋白質(zhì)的分離純化從破碎材料或細(xì)胞器提出的蛋白質(zhì)是不純的，需進(jìn)一步純化。純化包括將蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開，將各類不同的蛋白質(zhì)分開。選擇提取條件時(shí)，就要考慮盡可能除去ah蛋白質(zhì)。一樣老是有其它物質(zhì)伴隨混入提取液中。但有些雜質(zhì)（如脂肪）以事前除去為宜。先除去便于以后操作。經(jīng)常使用有機(jī)溶劑提取除去。關(guān)于異類物質(zhì)，提純蛋白質(zhì)和酶時(shí)?；煊泻怂峄蚨嗵?，一樣可用專一性酶水解，有機(jī)溶劑抽取及選擇性部份沉淀等方式處置。小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備進(jìn)程中通過量次液相與固相轉(zhuǎn)化中被分離或最后用透析法除去。而對(duì)同類物質(zhì)如酶與雜蛋白、RNA、DNA和不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間產(chǎn)分離，情形那么復(fù)雜得多。要緊采納的方式有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。其中鹽析法、等電點(diǎn)法及結(jié)晶法用于蛋白質(zhì)和酶的提純較多，有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核提純較多，柱層析法、梯度離心法對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的提純應(yīng)用十分普遍。如前所述，蛋白質(zhì)的分離純化較難，而且其本身的性質(zhì)又限制了某些方式的利用，因此要研究目的物的微細(xì)特點(diǎn)，巧妙的聯(lián)用各種方式并進(jìn)行周密的操作，同時(shí)有必要了解精制各進(jìn)程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白質(zhì)可利用吸收光譜等物理性質(zhì)或以相當(dāng)于單位氮活性增加為尺度進(jìn)行追蹤。其他蛋白質(zhì)可用電泳、超離心、層析、擴(kuò)散及溶解等測(cè)定純度。如結(jié)晶核糖核酸酶經(jīng)層析分為兩個(gè)成份?？梢妼?duì)確信蛋白質(zhì)結(jié)晶純度尚無(wú)最終的尺度。依照體會(huì)即或純凈的標(biāo)準(zhǔn)品，有極微量的不純物時(shí)，也會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來較大的阻礙。不穩(wěn)固的蛋白質(zhì)，如分離SH-酶時(shí)利用試劑及緩沖液等，Page7-109-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation要確認(rèn)不含重金屬離子（特級(jí)試劑也需檢定）。蛋白質(zhì)純化的操作如脫鹽、濃縮干燥等均與低分子化合物不同，必需通過獨(dú)特的繁瑣操作。蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)彼此分離要緊利用它們之間的各類性質(zhì)的微小不同。諸如分子形狀、分子量大小、電離性質(zhì)、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質(zhì)提取液中，除包括所需要的蛋白質(zhì)（或酶）夕卜，還含有其它蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸及肽類等雜質(zhì)。除去的方式有：1） 核酸沉淀法該法可用核酸沉淀劑和氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。必要時(shí)也可用脫氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗勻漿中加入少量DNase,于4°C保溫30?60min，可使DNA降解為足夠小的碎片，以致不阻礙以后的純化。2） 醋酸鉛沉淀法利用醋酸鉛沉淀劑除去雜蛋白。因這些沉淀劑也常常使需要的酶（或蛋白質(zhì)）緩緩變性而失去活性，因此用這種試劑時(shí)應(yīng)迅速進(jìn)行鹽析，使樣品與這種試劑離開接觸。3） 調(diào)pH值或加熱沉淀法利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的不同除去雜蛋白。利用蛋白質(zhì)的熱變性的溫度系數(shù)不同，可在必然的PH下將蛋白提取液加熱到必然的溫度，使對(duì)熱不穩(wěn)固的雜蛋白性沉淀而除去。4） 選擇性變性法利用各類蛋白質(zhì)穩(wěn)固性的不同，可用選擇性變性法來除去雜蛋白。例如胰蛋白酶及細(xì)胞色素C等少數(shù)專門穩(wěn)固的酶，乃至可用%三氯醋酸處置，現(xiàn)在其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白酶和細(xì)胞色素C那么仍留在溶液中。5） 透析法小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備進(jìn)程中多次液相與固彼此轉(zhuǎn)化中被分離，或最后用透析法除去。一、利用溶解度不同的純化方式原理：鹽析法關(guān)于許多非電解質(zhì)的分離純化均適合。對(duì)蛋白質(zhì)和酶的提純應(yīng)用也最先。至今還普遍利用，一樣粗抽提物常常利用鹽析法進(jìn)行粗分。也有反復(fù)用鹽析法取得純的蛋白質(zhì)的例子。其原理是蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加（鹽溶，與離子強(qiáng)度10?1間成比例增加）。球蛋白當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并前后析出（鹽析）（離子強(qiáng)度I2?10）。這是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的電荷的極性基團(tuán)有靜電引力。當(dāng)水中加入少量鹽時(shí)，鹽離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子一的極性基團(tuán)的阻礙，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加必然程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)彼此聚集而沉淀析出。鹽析法是依照不同蛋白質(zhì)在必然濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達(dá)到彼此分離的方式。鹽析時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度的關(guān)系，可用下式表示：S1g =-ksxlSo式中S0為蛋白質(zhì)在純水（離子強(qiáng)度1=0）中的溶解度，S為蛋白質(zhì)在溶液的離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度，KS為鹽析常數(shù)。離子強(qiáng)度可用下式計(jì)算。：1I=EmiZi22式中mi為溶液中各類離子摩爾濃度，Zi為各類離子的價(jià)數(shù)。①式中當(dāng)溫度一按時(shí)，S0關(guān)于某一蛋白質(zhì)在某溶液中的溶解度是一常數(shù)，故（1）式也改定為：lgS邛-ksxI-110-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation式中B=lgS0,也為一常數(shù)，B值要緊取決于蛋白質(zhì)性質(zhì)，第二與溶液的PH和溫度有關(guān)。ks值要緊和鹽的性質(zhì)（包括鹽離子價(jià)數(shù)和平均半徑）有關(guān)，也與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。一樣來說，蛋白質(zhì)在某一鹽液中ks愈大，鹽析成效愈好。蛋白質(zhì)是具有許多親水基團(tuán)的偶極離子，常需用要較高的I值才能從溶液中析出。依照（3）式分離純化蛋白質(zhì)，可在必然的PH和溫度下改變鹽的I值，稱為“ks分段鹽析法”，提純前期常應(yīng)用此法；也可在必然I值下改變PH及溫度，稱為“B分段鹽析法”，經(jīng)常使用于提純后期，專門是使某些蛋白質(zhì)結(jié)晶析出時(shí)。鹽的選擇：如上所述，蛋白質(zhì)在水中溶解度取決于蛋白質(zhì)分子上離子基團(tuán)周圍的水分子數(shù)量，即取決于蛋白質(zhì)的水合程度。因此，操縱水合程度，也確實(shí)是操縱蛋白質(zhì)的溶解度。操縱方式最常用的是加入中性鹽。要緊有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，它的優(yōu)勢(shì)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25r時(shí)飽滿和溶解度為,即767g/l;0°c時(shí)飽滿和溶解度為,即676g/l）。在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)都可鹽析出來，且硫酸銨價(jià)廉易患，分段成效較其它鹽好，不易引發(fā)蛋白質(zhì)變性。應(yīng)用硫酸銨時(shí)對(duì)蛋白氮的測(cè)定有干擾，另外緩沖能力較差，故有時(shí)也應(yīng)用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白，用硫酸鈉的效果也不錯(cuò)，硫酸鈉的缺點(diǎn)是30C以下溶解度太低。其它的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但也由于溶解度太低，受溫度阻礙大，故應(yīng)用不廣。氯化鈉的溶解度不如硫酸銨，但在不同溫度下它的溶解度轉(zhuǎn)變不大，這是方便的地方。它也是廉價(jià)不易純化的試劑。硫酸銨濃溶液的PH常在?之間，市售的硫酸銨還常含有少量游離硫酸,PH值往往降至以下，當(dāng)用其他PH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)劑.硫酸銨飽和度計(jì)算及加入方式在分段鹽析時(shí)，加鹽濃度一樣以飽和度表示，飽和溶液的飽和度為100%。用硫酸銨鹽析時(shí)其溶液飽和度調(diào)整方式有3種。一種是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大所需調(diào)整的濃度不高時(shí)，加入飽和硫酸銨溶液。配制法是加入過量的硫酸銨，熱至50?60°C保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱濾去沉淀，再生0C或25C下平穩(wěn)1?2天，有固體析出時(shí)即達(dá)100%飽和度。鹽析所需飽和度可按下式計(jì)算：S2-S1V=V0 1-S2式中V及V0別離代表所需飽和硫酸銨溶液及原溶液體積，S2和S1別離代表所需達(dá)到的和原溶液的飽和度。嚴(yán)格來講，混合不同體積的溶液時(shí)，整體積會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變使上式造成誤差，但這由體積改變所造成的誤差一樣小于2%，可忽略不計(jì)。另一種是所需達(dá)到飽和度較高而溶液的體積又再也不過度增大時(shí)，可直接加固體硫酸銨，其加入量可按下式計(jì)算：G(S2-S1)X= 1-AS2式中X是將1I飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時(shí)所需硫酸銨的重量(g)，G及A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。G在0C時(shí)為707，20C時(shí)為756，A在0C時(shí)為，20C時(shí)為在室溫及0C時(shí)所需硫酸銨飽和度可查表。第3種調(diào)整飽和度的方式是將鹽析的樣品液裝于透析袋內(nèi)對(duì)飽和硫酸銨進(jìn)行透析，此法濃度轉(zhuǎn)變較持續(xù)，可不能顯現(xiàn)鹽的局部太高現(xiàn)象，但鹽析時(shí)測(cè)定鹽的飽和度手續(xù)較繁，運(yùn)用較少。確信沉淀蛋白質(zhì)所需硫酸銨濃度的方式將少量樣品冷卻到0?5°C，然后攪拌加入固體硫酸銨粉末，見蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀時(shí)，離心除去沉淀，分析上清液確信所要蛋白質(zhì)的濃度，如它仍在溶液中那么棄去沉淀，再加更多的硫酸銨于上清液中，直到產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀時(shí)止。以所要提取的蛋白質(zhì)在溶液中的濃度對(duì)硫酸銨濃111-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation度作圖，得沉淀曲線，找出蛋白質(zhì)開始沉淀的濃度。如不考慮收率，飽和度區(qū)間可取得窄一些，使純度高一些。鹽析時(shí)注意的幾個(gè)問題：鹽的飽和度不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組成的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每顯現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離心或過濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第2種蛋白質(zhì)沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)飽和度達(dá)20%時(shí)，纖維蛋白原第一析出；飽和增至28?33%時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33?50%時(shí)，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時(shí)清蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液中分離取得9種以上蛋白質(zhì)及酶。PH值pH值在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小易沉淀析出。因此鹽析時(shí)除個(gè)別特殊情形外，pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)周圍。由于硫酸銨有弱酸性，它的飽和溶液的pH值低于7，如所要蛋白質(zhì)遇酸易變性那么應(yīng)在適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行。蛋白質(zhì)濃度在相同鹽析條件下蛋白質(zhì)濃度愈高愈易沉淀。利用鹽的飽和度的極限也愈低。如血清球蛋白的濃度從%增至%時(shí)，需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%.某一蛋白質(zhì)欲進(jìn)行兩次鹽析時(shí),第1次由于濃度較稀，鹽析分段范圍較寬,第2次那么慢慢變窄.例如膽堿酯酶用硫酸銨鹽析進(jìn)時(shí)，第1次硫酸銨飽和度為35%至60%,第2次為40%至60%.蛋白質(zhì)濃度高些盡管對(duì)沉淀有利，但濃度太高也易引發(fā)雜蛋白的共沉作用.因此，必需選擇適當(dāng)濃度盡可能幸免共沉作用的干擾。溫度由于濃鹽液對(duì)蛋白質(zhì)有必然愛惜作用，鹽析操作一樣可在室溫下進(jìn)行。至于某些對(duì)熱特別靈敏的酶，那么宜維持低溫條件。通常蛋白質(zhì)鹽析時(shí)對(duì)溫度要求不太嚴(yán)格。但在中性鹽中結(jié)晶純化時(shí)，溫度阻礙那么比較明顯。脫鹽蛋白質(zhì)用鹽析法分離沉淀后，常需脫鹽才能取得純品。脫鹽方式最經(jīng)常使用的是透析法。透析法所需時(shí)刻較長(zhǎng)，常在低溫下進(jìn)行并加入防腐劑幸免微生物污染。透析利用前必需處置，方式是將透析袋置于LEDTA溶液中煮，棄去溶液，用蒸鎦水洗凈,置50%甘油中保存?zhèn)溆谩Ｒ部捎梅肿雍Y層析，經(jīng)常使用SephadexG-25柱層析法，上樣不要超過床體積的20%。另外，有些金屬離子能和蛋白質(zhì)形成較為專一的結(jié)合而使蛋白質(zhì)沉淀。這雖不是典型的鹽析，但在制備蛋白質(zhì)中有許多成功的例子。鋅離子在特定pH下與胰島素結(jié)合形成沉淀就是這種例子。蛋白質(zhì)從懸浮液中沉淀出來的速度極慢，必需用強(qiáng)力離心來增進(jìn)那個(gè)進(jìn)程。2、有機(jī)溶劑分離純化法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，致使溶解度降低。有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在必然濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮，由于有機(jī)溶劑的加入易引發(fā)變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱量，操作一樣宜在低溫下進(jìn)行，且在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。用此法所析出的沉淀一樣比鹽析法易過濾或離心沉降。分離后的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)當(dāng)即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑的濃度。操作時(shí)的pH值大多數(shù)操縱在待沉淀蛋白質(zhì)等電點(diǎn)周圍。有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度，減少變性和提高分離的成效。一樣在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)添加中性鹽的濃度在左右，過量不僅花費(fèi)有機(jī)溶劑，而且可能致使沉淀不行.沉淀的條件一經(jīng)確信，就必需嚴(yán)格操縱，才能取得重復(fù)性結(jié)果.有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度素示.故操作條件比鹽析法嚴(yán)格。許多有機(jī)溶劑，如碳鏈較長(zhǎng)的醇，它溶于水，但有限度。其量大到必然程度后那么分成兩112-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation相，一相以水為主，一相以有機(jī)溶劑為主。某些第3組分的存在能夠改變兩相的比例和組成。有許多蛋白質(zhì)在兩相中均能溶解，形成份配。在同一個(gè)兩相的溶劑系統(tǒng)中，不同的蛋白質(zhì)有不同的分派系數(shù)。依照這一原理，操作全數(shù)機(jī)械化的有逆流分溶。因要求實(shí)驗(yàn)室溫度恒定且操作也繁雜，雖一直有人在用但很不普遍。分派層析也是應(yīng)用這一原理，但在分離純化蛋白質(zhì)工作頂用得不多，主若是因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中，專門是在易與水分相的溶劑中溶解度小且易變性。疏水層析是最近幾年進(jìn)展的新方式。它利用蛋白質(zhì)表面有一部份疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)結(jié)合。洗脫時(shí)將鹽濃度慢慢降低，蛋白質(zhì)因疏水性不同而逐個(gè)地前后被洗脫而純化。此法能分離其它一些方式不易純化的蛋白質(zhì)。利用分子形狀和大小不同的分離方式蛋白質(zhì)形狀有細(xì)長(zhǎng)的如纖維，有密實(shí)的如圓球，形狀很不相同。蛋白質(zhì)的分子量從6000左右開始，有各類大小，大的能夠大到幾百萬(wàn)。利用這些不同，有幾種方式可用粉離蛋白質(zhì)。凝膠層析：屬最經(jīng)常使用的蛋白質(zhì)分離方式。系混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。所指凝膠從廣義上說是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如天然物質(zhì)中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子互換基團(tuán)的葡聚糖凝膠等。把適當(dāng)?shù)哪z顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，于柱內(nèi)加入欲分離的混合物，然后用大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物質(zhì)的分子大小和形狀不同，在洗柱進(jìn)程中，分子量最大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。整個(gè)進(jìn)程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質(zhì)在分離進(jìn)程中的阻滯減速現(xiàn)象，有人也稱之為阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等。凝膠過濾是分子篩的一種，在介紹凝膠過濾法之前，首先介紹分子篩的由來。McBain(1928)提出了分子篩的概念。后來發(fā)覺這一現(xiàn)象在許多地址都存在。Synge與Tiselins(1950)在說明凝膠層中的電泳和電滲現(xiàn)象時(shí)引用了分子篩的概念。爾后發(fā)此刻柱層析中也有這種現(xiàn)象，于是許多工作者嘗試了一系列適用于生物高分子分離純化用的分子篩。至1959年P(guān)orath與Flodim找到部份水解的葡聚糖凝膠將其交聯(lián)，取得了商品名為交聯(lián)葡聚糖(Sephadex）的分子篩。該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質(zhì)的分離分析中已被普遍采用。Lathe與Ruthven（1956）曾利用分子篩效應(yīng)測(cè)定過度子大小與分子量。Flodin與Granath（1961）發(fā)覺不同分子量的葡聚糖級(jí)分，其凝膠過濾行為與分子量大小有關(guān)。Andrew（1962） 發(fā)覺蛋白質(zhì)中也有類似的性質(zhì).爾后通過很多人的實(shí)際應(yīng)用，完善了這一方式，形成一個(gè)靠得住的測(cè)定高分子分子量的方式。凝膠層析是60年代初進(jìn)展起來的一種快速而又簡(jiǎn)便的分離技術(shù)。由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便和不需要有機(jī)溶劑，和對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離成效，因此目前它已被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域普遍應(yīng)用。PH值：與沉淀蛋白質(zhì)或酶原理相同，結(jié)晶的溶液PH值一樣選擇在被結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶的等電點(diǎn)周圍，以利于晶體的析出。溫度：除少數(shù)情形外，通常選擇低溫條件進(jìn)行。低溫條件對(duì)蛋白質(zhì)和酶不僅溶解度低且不易變性。在中性鹽溶液中結(jié)晶時(shí)，溫度可在0°C至室溫范圍內(nèi)選擇，在有機(jī)溶劑中結(jié)晶一樣要求溫度較低。113-蛋白質(zhì)提取與制備ProteinExtractionandPreparation晶種：不易結(jié)晶蛋白質(zhì)和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶結(jié)晶可致使大量結(jié)晶的形成。有時(shí)用玻璃輕輕摩擦容器壁也可達(dá)到此目的。需加晶種才能形成結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶，大多數(shù)結(jié)晶收率都不高。金屬離子：有些蛋白質(zhì)和酶結(jié)晶時(shí)還需加入金屬離子，如鐵蛋白在硫酸銨溶液中結(jié)晶時(shí)，加入少量鎘離子才形成菱狀結(jié)晶，烯醇化酶也常加入汞鹽后形成結(jié)晶。結(jié)晶時(shí)刻：在結(jié)晶條件比較適合的情形下，在幾小時(shí)乃至幾分名即可取得結(jié)晶。但有些情形需數(shù)天乃至數(shù)月才能結(jié)晶完全，視各類蛋白質(zhì)和酶的具體情形不同而定。蛋白質(zhì)和酶的結(jié)晶大多數(shù)是針狀、棒狀、片狀，有的為八面體或立方體的菱狀結(jié)晶。結(jié)晶的大小與結(jié)晶時(shí)刻及條件有關(guān)。干燥：干燥是將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分（或溶劑）蒸發(fā)除去的進(jìn)程。依照水分在固體中散布情形可分為表面水分、毛細(xì)管水分和被膜所包圍的水分3種。表面水分附著于固體表面，蒸發(fā)時(shí)完全暴露于外界空氣中，干燥最快、最均勻。毛細(xì)管水分存在于固體極細(xì)孔隙的毛細(xì)管中，水分子逸出比較困難，蒸發(fā)時(shí)慢并需較高溫度。膜包圍的水分如細(xì)胞中被細(xì)胞質(zhì)膜所包圍的水分，需經(jīng)緩慢擴(kuò)散至膜外才能蒸發(fā)最難除去。被干燥的物質(zhì)其濕度與周圍空氣的濕度是一個(gè)動(dòng)態(tài)平穩(wěn)關(guān)系，暴露于大氣中的物質(zhì)是可不能絕對(duì)干燥的。假設(shè)使被干燥的物質(zhì)所含水分低于周圍空氣中水分，那么必需放在周密封蓋的容器中進(jìn)行干燥。用這種方式可取得含水量極低的干燥樣品，生物大分子制備取得所需的產(chǎn)品后，為了避免變質(zhì)易于保留和運(yùn)輸，常需要干燥處置，最經(jīng)常使用的方式是冷凍干燥和真空干燥，某些無(wú)活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產(chǎn)品那么較多地應(yīng)用噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。真空干燥在相同溫度下，被干燥物質(zhì)所含水分或溶劑由于周圍空氣壓力的降低蒸發(fā)速度增加。真空度愈高，溶劑沸點(diǎn)愈低，蒸發(fā)愈快。其原理與真空濃縮（或稱減壓濃縮）相同。真空干燥適用于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥和保留，整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器、及真空泵3部份。干燥器頂部連接一帶活塞的管道接通冷凝器，氣化后的蒸氣由此管道通過冷凝管凝聚，冷凝器另一端連接真空泵，干燥器內(nèi)常放一些干燥劑如五氧化二磷、無(wú)水氯化鈣等，以便干燥保留樣品。冷凍真空干燥冷凍真空干燥除利用真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素。在相同的壓力下，水蒸氣壓隨溫度的下降而下降。在低溫下低壓下冰很容易升華為氣體。操作時(shí)通常將等干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。干燥后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、維持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢(shì)，適用于各類生物大分子的干燥保留。樣品干燥時(shí)先在培育皿內(nèi)鋪成薄層（厚度不超過1cm的液體），置于低溫冰箱內(nèi)凍固。另在真空干燥器內(nèi)用兩個(gè)培育皿別離放置固體氫氧化鈉和五氧化二磷，真空干燥上端抽氣通過五氧化二磷干燥管與真空泵相連。當(dāng)放進(jìn)等待干燥的凍塊后，當(dāng)即封鎖干燥器，開動(dòng)真空泵，紅5?10h后得冷凍干燥品。也可將待干燥物質(zhì)置于圓底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷卻劑中，容器內(nèi)液體迅速凍成固體，抽真空后等干燥凍塊的水分子升華變成氣體，通過冷凝器凝結(jié)為霜。冰凍的樣品慢慢失去水分變成疏松的干燥粉末。上述