玉米莖腐病菌產生的細胞壁降解酶

莖腐?。ㄋ追Q青腐?。┦且环N高度廣泛分布于中國的土壤傳播疾病，通常發(fā)生在中國的所有玉米產區(qū)。目前，國內外對該病的病因和發(fā)生規(guī)律的科學研究很多，但對該病的病因和作用機制的系統(tǒng)研究卻很少。由于病菌產生的細胞壁降解酶是病菌侵入寄主的主要手段,因此明確莖腐病菌產生的細胞壁酶種類及活性,對深入研究莖腐病菌的致病機理具有重要意義。1材料和方法1.1玉米中莖腐病菌的分離培養(yǎng)按Bateman的方法從人工接種后20d發(fā)病的玉米幼苗根系的病健交界處剪取0.5cm長的病組織,隨機加入0.25mol/LNaCl提取液(1.0MTris-HCl緩沖液,pH8.0),每克鮮組織加5ml提取液,在4℃下研磨,再經過過濾、沉淀、透析等過程,最后獲得純化的酶。-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｎ唇臃N的玉米幼苗作對照。按Papavizas和Ayers(1965)的方法將莖腐病菌在Marcus等細胞壁降解酶誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)。病菌培養(yǎng)6d或10d后,提取細胞壁降解酶。細胞壁降解酶的純化與從病株提取的酶液相同。1.2重組菌ylgalacturonse,cx纖維素酶活性的測定采用紫外—可見光分光光度法測定細胞壁降解酶的活性。利用二硝基水楊酸試劑(DNS),通過日本島津UV-120-02分光光度計在520nm處測定反應混合液釋放的還原糖,計算出PG(polygalacturonase,多聚半乳糖醛酸酶)、PMG(polymethylgalacturonase,聚甲基半乳糖醛酸酶)、Cx(纖維素酶,即β-1,4-內切葡聚糖酶)的活性。酶活單位為30℃下每分鐘每毫克酶蛋白催化底物釋放1.0μg還原糖。按Hoffman(1982)方法在232nm處測定PGTE(polygalacturonicacidtrans-eliminase,多聚半乳糖醛酸反式消除酶)和PMTE(pectinmethyltrans-eliminase,果膠甲基反式消除酶)的活性。30℃下每分鐘每毫克酶蛋白催化底物釋放1.0μmol不飽和醛酸為一個酶活單位(U/mg)。按Marcus和Schejter方法測定PE(pectinmethylesterase,果膠甲基酯酶)的活性。在pH6.5下連續(xù)用0.01NNaOH滴定酶作用后所釋放的羧基。PE酶活單位為30℃下每分鐘每毫克酶蛋白催化底物釋放的羧基微克當量數。2結果與分析2.1種病原菌活體內f.gramenratum和p.aphen充2種玉米莖腐病菌Pythiumaphanidermatum和Fusariumgraminearum在活體內外均能產生PG、PMG、PGTE和Cx。F.graminearum在活體內和活體外均能產生PMTE和PE,而P.aphanidermatum只在活體內產生、在活體外不產生這2種酶。F.graminearum在活體外產生的細胞壁降解酶中,活性依次為PG、PMG、Cx、PE、PGTE和PMTE;在活體內,活性依次為PG、PMG、Cx、PMTE、PGTE和PE。P.aphanidermatum在活體外,活性依次為PMG、Cx、PG和PGTE;在活體內,活性依次為PG、PMG、Cx、PGTE、PMTE和PE。由此看來,無論是F.graminearum還是P.aphanidermatum活體內與活體外產生的細胞壁降解酶活性都存在差異。F.graminearum產生的各種細胞壁降解酶活性都高于P.aphanidermatum。除PGTE和PMTE外,2種病菌活體外產生的細胞壁降解酶活性均高于活體內產生的酶活。結果還表明,接種病菌后,病組織內各種細胞壁降解酶的活性顯著高于未接種的健康植株(對照),說明接種病菌后,病菌在寄主組織內可能產生了細胞壁降解酶或刺激寄主本身酶活性提高(表1)。2.2水稻提取物闡明劑的動態(tài)特性是由干旱引起的2.2.1溫度對產物活性的影響由圖1可以看出,溫度對細胞壁降解酶有不同程度的影響,其中PG和PGTE酶活隨溫度的變化波動性較大,表現(xiàn)為典型的鐘形曲線,酶活最適溫度分別為50℃和30℃。溫度對PMG的活性影響不明顯,酶活最適溫度為40℃。Cx只有在溫度高于20℃時才表現(xiàn)出活性,在20~50℃之間酶活波動程度較大,酶活最適溫度為40℃。PMTE最適溫度在20℃和30℃之間。2.2.2ph對處理cod的影響以KH2PO4-K2HPO4為緩沖體系,分別在pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下測定F.graminearum在活體外產生的PG、PMG、PGTE、PMTE、和Cx的活性,找出不同酶活最適pH值。結果表明:pH對細胞壁降解酶的活性亦有不同程度的影響。PG受pH的影響最為明顯,呈現(xiàn)典型的鐘形曲線,最適酶活pH為6.0。PMG最適酶活為pH5.0,pH大于5.0時,酶的活性逐漸降低,當pH大于8.0時,PMG酶活完全喪失。Cx隨pH的變化也基本呈鐘形曲線,酶活最適pH為6.0,在pH超過8.0時,酶的活性變?yōu)樽畹?。在pH5.0~9.0范圍內,PGTE和PMTE活性隨pH值的增大而逐漸增大,在pH9.0時最大(圖2)。2.2.3反應時間對產酶的影響由圖3可以看出,隨著反應時間延長,PG酶的活性逐漸增大,當反應時間為60min時,酶活達到最大值,反應時間超過60min時,酶的活性不再增大并維持最大值。由此看出,PG酶活與反應時間長短亦有密切關系,酶活最適反應時間為60min。2.2.4pg最大響應的確定配制5%的果膠酸鈉(緩沖液為50mmol/L的醋酸-醋酸鈉,pH5.0),然后依次稀釋5、10、15、20和25倍。用DNS方法測定PG與上述各濃度底物在30℃下反應30min時的還原糖產量,再計算出不同底物濃度下的反應速度(單位時間產物濃度的變化,mg/ml·min)。以底物濃度的倒數為橫坐標,以反應速度的倒數為縱坐標繪制直線關系圖,并確定PG的最大反應速度Vmax和米氏常數Km。由試驗結果可知,底物濃度為0%~5%范圍內,隨著底物濃度的增加,在活體外產生的PG的酶活(反應速度)不斷增加,符合Michaelis-Menten理論。直線與縱坐標的交點為1/Vmax,直線延線與橫坐標的交點為1/Km。以底物濃度的倒數(X)對反應速度的倒數(Y)建立直線方程:Y=4.5462+0.1687X(R=0.9995),相關極顯著。經計算,最大反應速度Vmax為0.22mg/ml·min,米氏常數Km為0.037。3討論3.1聯(lián)合用藥對莖腐病的影響研究證實,2種莖腐病菌在活體內外均能產生一系列細胞壁降解酶,反映了莖腐病除具有枯萎病的特性之外,還具有腐爛病的特性,在2種莖腐病菌當中,F.graminearunm產生的細胞壁降解酶活性比較高,說明以往在F.graminearum引起莖腐病的機制研究中偏重于毒素的作用不夠全面,鐮刀菌產生的細胞壁降解酶在引起莖腐病的苗期根腐及后期莖基維管束組織降解中可能也起到重要作用。由于在諸降解酶中,PG、PMG和Cx不論在活體內還是活體外其活性均很高,因此該3種酶為莖腐病菌產生的最主要的細胞壁降解酶。3.2c、x和p-葡萄糖苷酶2種病菌在活體內和活體外產生的細胞壁降解酶活性差異較大,這可能與活體內、外的條件不同有關,因此在研究細胞壁降解酶作用機制時,不能僅僅用活體外產生的酶。研究中還發(fā)現(xiàn)纖維素酶在活體外只有培養(yǎng)10d以后才能測出從底物釋放的還原糖,但莖腐病菌卻很容易在以羧甲基纖維素做唯一碳源的培養(yǎng)基中生長,培養(yǎng)2d羧甲基纖維素粘度就明顯降低,說明Cx誘導產生需要一定的時間。根據現(xiàn)代C1-Cx概念,天然結晶纖維素先與C1酶作用產生葡聚糖短鏈,然后由Cx作用后產生纖維二糖,β-葡萄糖苷酶最后將纖維二糖分解成葡萄糖。在健康組織中,除PE未檢測到活性外,PG、PMG、Cx、PGTE和PMTE均檢測到了活性,但比其在病株內的活性低得多。因此病株內這些酶活性較高是因為植株內環(huán)境有利于病菌產生這2種酶,還是病菌侵染刺激了寄主本身的2種酶活性提高所致,值得進一步研究。3.3提高病毒對克氏原螯蝦細胞的抗菌能力由于莖腐病菌可以產生一系列細胞壁降解酶,而且研究還發(fā)現(xiàn)以PG為主的