金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

世界衛(wèi)生組織（who）宣布，食物起源疾病和食品污染已成為世界公共衛(wèi)生問題。每年發(fā)生的食源性疾病近數(shù)十億例,發(fā)達(dá)國家每年至少有三分之一的人群患食源性疾病,其中約有170萬15歲以下兒童因食源性微生物污染引起腹瀉而死亡。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,簡稱金葡菌)是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一。無論在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家,由金葡菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占有較大比例。該菌在自然界中分布廣泛,在人體中主要存在于皮膚、粘膜,特別是鼻咽部,30%~80%的人群為該病原菌的攜帶者,因此金葡菌污染食品的幾率較大。在美國,大約每年超過185000人發(fā)生金黃色葡萄球菌食物中毒,其中約1750人住院,每年損失約15億美元;在歐盟,1993~1998年報告的金黃色葡萄球菌食物中毒共926起,占食源性疾病的4.5%。日本的調(diào)查結(jié)果表明,平均32.5%的食品存在金葡菌的污染。據(jù)美國CDC報告,金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌,居第2位,占細(xì)菌性食物中毒的33%。加拿大金葡萄的發(fā)生率更高,占細(xì)菌性食物中毒的45%,其引起的食物中毒也已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。近年來,我國每年由金葡菌引起的食物中毒事件已居第4位。鑒于此,采集7種食品樣品,分離、鑒定其中污染的金黃色葡萄球菌,探討該菌在食品中的污染狀況,為預(yù)防由其引起的食源性疾病的暴發(fā)、流行及追蹤污染源提供依據(jù)。1材料和方法1.1生鮮牛乳樣品2006年7月到2007年7月共采集樣品510份。除生鮮牛乳60份樣品采自保定市市郊奶戶外,其余450種樣品均采自保定各超市及農(nóng)貿(mào)市場。樣品分類見表1。1.2pcr法測定電子天平高速冷凍離心機5417R,上海安亭科學(xué)儀器廠;電子恒溫水浴鍋HH.SY11-Ni,北京市光明醫(yī)療儀器廠;TGradientThermocycler96型PCR儀,德國Biometra公司;DYCp-32型電泳槽,北京市六一儀器廠;FA1004電子天平,上海天平儀器廠;DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,北京市六一儀器廠;BTS-20M型凝膠成像系統(tǒng),德國UVITEC公司。1.3培養(yǎng)基胰酪胨大豆肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、肉浸液肉湯、滅菌鹽水、兔血漿均為本試驗室自制。1.4標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC13565、ATCC25923均購自中國普通微生物菌種保藏中心。1.5分離和鑒定方法1.5.1金葡菌的分離和鑒定1.5.2uc基因驗證由于一些非金葡菌菌株可能產(chǎn)生大量的活性很高的蛋白酶(假凝固酶),導(dǎo)致假陽性,所以采用PCR擴增耐熱核酸酶(nuc)基因的方法對所獲菌株進(jìn)行驗證。nuc基因為金黃色葡萄球菌DNA片斷高度保守序列,該基因編碼金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶,是金黃色葡萄球菌所特有的。引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR擴增程序:94℃預(yù)變性4min,94℃1min→58℃0.5min→72℃1.5min,30個循環(huán),最后72℃延伸3.5min。2結(jié)果與分析2.1血平板的質(zhì)量510份樣品經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢后得到疑似金黃色葡萄球菌的菌株,經(jīng)血漿凝固酶試驗和PCR擴增耐熱核酸酶鑒定(見圖1)后,108份樣品被檢出金葡菌。國標(biāo)規(guī)定,金葡菌在血平板上生長菌落呈金黃色,有時為白色,菌落周圍有溶血圈。但試驗中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌落在血平板上呈白色,僅個別呈金黃色,同時溶血圈的大小也有差異,且此差異僅出現(xiàn)在不同種類樣品所分離的菌株中,這與不同菌株的溶血能力有關(guān),但血平板的質(zhì)量也是一個重要的因素。將同一批菌株接種于不同批次的血平板上,不同批次的血平板上出現(xiàn)的溶血圈有的差異明顯,而有的血平板上的標(biāo)準(zhǔn)菌株觀察不到溶血圈,表明血平板的質(zhì)量對于此項鑒定很重要。試驗中可用標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線于血平板作陽性對照,以防因血平板的質(zhì)量問題而出現(xiàn)漏檢。血漿凝固酶試驗中,國標(biāo)規(guī)定,如血漿呈現(xiàn)凝固,即將試管傾斜或倒置時呈現(xiàn)凝塊者,被確認(rèn)為陽性結(jié)果。其中呈現(xiàn)凝固沒有定量的標(biāo)準(zhǔn),試驗中有些菌株凝固得牢固,而有些菌株的凝塊具有大小不一的流動性。將出現(xiàn)半凝(不包括纖維狀和絮狀沉淀的凝固)的菌株提取基因組進(jìn)行耐熱核酸酶PCR擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有1株半凝的菌株沒有跑出特異性條帶,而出現(xiàn)全凝的菌株有3株未出現(xiàn)特異性條帶?？梢?不能僅憑血漿凝固酶試驗來鑒定金黃色葡萄球菌。2.2不同種類及微生物菌的檢出情況對采集的7大類食品樣品進(jìn)行金葡菌的分離鑒定,結(jié)果見表3。金葡菌對7類樣品均有污染,但其污染程度存在明顯的差異。其中,生牛乳(38.3%)和速凍食品(34%)中該菌的檢出率高于日本報道的平均值(32.5%);生肉及熟肉制品的總檢出率高于生鮮肉;水產(chǎn)品、豆制品和果蔬的檢出率較低,從而導(dǎo)致檢出率的平均值低于報道值,這與所采集樣品的種類、采集地點有很大的關(guān)系。2.3在不同的樣品中，金色葡萄園的污染2.3.1生鮮乳中金葡菌的檢測本試驗中生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為38.3%。該菌在生牛乳中的檢出率有國家及地區(qū)的差異,檢出率在12%~79%之間不等。我國生牛乳中金葡菌的檢出率在15%~38%[12~15]。Wilon等報道,世界上約有1%~2%的奶?；加懈鞣N類型的乳腺炎,其中約有35%的奶?；加衼喤R床型乳腺炎,金葡菌是引起乳腺炎的重要病原菌,而患有乳腺炎的奶牛是污染生鮮乳的主要原因。此外,生鮮乳擠出后,由于貯藏罐和環(huán)境等消毒不合格,也會造成生鮮乳的二次污染,這些原因共同導(dǎo)致了生鮮乳中金葡菌的高檢出率。Terayama報道農(nóng)戶奶桶和農(nóng)場奶罐中的污染率分別為65.9%和65.4%。國內(nèi)曾有人采集了340份生鮮乳進(jìn)行檢測,奶牛個體和混裝奶桶(罐)生鮮乳的污染率分別為39.0%和58.8%。因此,要減少金葡菌對牛乳的污染,除降低牛乳腺炎的患病率外,還應(yīng)注意對貯藏罐和環(huán)境的消毒,避免二次污染的發(fā)生。2.3.2克氏原螯蝦對高檢出的影響生鮮肉中金黃色葡萄球菌的檢出率為生鮮豬肉(50份)、生鮮牛肉(50份)、生鮮羊肉(50份)和生鮮雞肉(50份)的平均值,其各自的檢出率如圖3所示。生肉中金黃色葡萄球菌主要來源于恒溫動物(包括人類)及環(huán)境,在適合的條件下產(chǎn)生腸毒素。生肉制品在食物鏈中對食源性致病菌的傳播起重要的作用,其中的金黃色葡萄球菌往往成為其它產(chǎn)品(如熟食等)污染的重要來源。本試驗中將生肉分為4類進(jìn)行檢樣,主要是考慮到各種生肉的銷售環(huán)境相似,但不同種屬動物生長及宰殺環(huán)境不同,宰殺后的帶菌率也可能不同。從圖3可以看出,生雞肉的檢出率明顯高于其余3種生鮮肉。有報道稱金葡菌在雞舍環(huán)境中分布廣泛,是一種很常見的條件性致病菌,存在于雞的皮膚、羽毛、呼吸道以及腸道中,因此導(dǎo)致雞肉的高檢出率。說明不同種屬、不同飼養(yǎng)環(huán)境對金葡菌的存在有一定影響。2.3.3金葡菌檢驗結(jié)果采集的肉制品包括生肉制品30份和熟肉制品20份。分別從10份生肉制品和5份熟肉制品中分離出了金葡菌,結(jié)果見表4。生肉制品(生肉包子餡)受金葡菌的污染狀況遠(yuǎn)高于上述生鮮肉(21%)的污染狀況。這些生肉餡均采自路邊的包子鋪,餡料的加工方式多為手工加工,再加上周圍環(huán)境的污染,使金葡菌的檢出率很高。20份熟肉制品中檢出金葡萄的5份樣品均采自衛(wèi)生環(huán)境較差的集貿(mào)市場。2.3.4金葡菌污染的變化速凍食品:30份肉類(餛鈍、水餃、肉丸類)速凍食品和20份非肉類速凍食品(湯圓、春卷、粽子等)。其中15份肉類速凍食品和2份湯圓中被檢出金葡菌,見表5。據(jù)報道,冰棍中金葡菌可存活2年以上,在模擬冰淇淋中可存活7年之久,因此冷凍食品一旦被污染金黃色葡萄球菌,可長時間帶菌,食用后誘發(fā)疾病。本試驗中肉丸類速凍食品金葡萄的檢出率高達(dá)75%。速凍食品受金葡菌污染的主要來源是加工用餡料,其原因可能是餡料加工過程中諸多環(huán)節(jié)的影響造成的。此外,肉餡本身容易染菌,導(dǎo)致肉類速凍食品的污染幾率高于非肉類速凍食品。2.3.5水產(chǎn)品和水果中金葡菌的檢出情況所檢豆制品中,27份為即食型塑料袋裝豆干類食品和紅豆餡,23份為散裝豆制品和綠豆飲料。其中,1份豆干類食品和1份綠豆飲料被檢出金葡菌。水產(chǎn)品中4份樣品被檢出金葡萄,其中3份來自于大型超市,1份來自于集貿(mào)市場。金葡菌在水產(chǎn)品中的檢出率不高,但其在衛(wèi)生條件較差的集貿(mào)市場的檢出率反而比超市的低,分析原因可能是由于集貿(mào)市場細(xì)菌多,一些雜菌的生長抑制了金葡菌的活性,導(dǎo)致檢出率偏低。31份水果中5份樣品被檢出金葡菌,19份蔬菜樣品中均未檢出金葡萄。被檢出金葡菌的水果采集于臨街一水果攤,周圍車輛、行人較多,可能是空氣、灰塵及人手污染所致。2.4生鮮乳、生鮮食、豬肉的來源金葡萄在7類食品中的分布比例如圖3所示。從圖3可以看出,金葡菌主要來源于生鮮乳、生鮮肉、速凍食品和肉制品,其中生鮮肉所占比例最大,這與生鮮肉來自4種樣品,樣品基數(shù)(200份)大有關(guān)。其次為生鮮乳、速凍食品和肉制品。其中,肉類速凍食品的金葡萄污染高于其它速凍食品。3金葡菌污染食品。為了引起食品安全風(fēng)險(1)金黃色葡萄球菌作為一種主要的食源性致病菌一直是醫(yī)學(xué)界研究的重點。這是因為金葡菌在食品中分布的廣泛性及對不良環(huán)境的抵抗能力在非芽孢菌中最強,能產(chǎn)生耐熱的腸毒素,普通的烹飪條件無法使其失活。因此,在選購食品時建議選擇知名品牌的合格商品,應(yīng)在陰涼、通風(fēng)、干燥、低溫處貯藏食品,以防止金葡菌腸毒素的產(chǎn)生。(2)金黃色葡萄球菌可通過以下途徑污染食品:食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌,造成食品污染,有20%~30%葡萄球菌腸毒素食物中毒是由此引起的;加工前食品帶菌或加工過程受到污染,產(chǎn)生腸毒素,引起食物中毒;熟食制品包裝不嚴(yán),運輸過程受到污染。由此可見,金葡菌污染食品的機會很多。本試驗中金葡菌的平均檢出率21.2%,表明市售的各種食品中,此菌的污染情況不容忽視,應(yīng)注意防止金葡菌引起的食物中毒。(3)由于人體表及呼吸道帶菌,使加工的生肉制品更容易受到污染。本試驗中肉制品的檢出率(30%)明顯高于生鮮肉的(21%)。其中生肉餡的金葡菌檢出率最高達(dá)83.3%,從而證明了手工加工使食品污染金葡菌的幾率加大。食品加工過