dna指紋技術(shù)在瘤胃微生物研究中的應(yīng)用

根據(jù)不同程度的微生物識(shí)別技術(shù)可分為以下四個(gè)方面：（1）形式和生活習(xí)性。如觀(guān)察微生物形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)、酶反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)要求和生長(zhǎng)條件等。(2)細(xì)胞組分。采用化學(xué),光譜、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)細(xì)胞組成分如胞壁成分、脂類(lèi)、醌類(lèi)、細(xì)胞氨基酸庫(kù)、色素等的分析。(3)蛋白質(zhì)。采用氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學(xué)反應(yīng)等技術(shù)分析細(xì)胞蛋白質(zhì)。(4)基因。包括(G+C)mol%含量測(cè)定,核酸分子雜交,遺傳信息轉(zhuǎn)化和傳導(dǎo),DNA或RNA序列分析等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因水平的鑒定方法逐漸成為微生物鑒定的主要手段,其鑒定結(jié)果也更具有說(shuō)服力。1腫瘤胃微生物分子水平研究的主要出發(fā)點(diǎn)1.1srdna分子核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。1953年首先在植物細(xì)胞發(fā)現(xiàn),1954在動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這種結(jié)構(gòu),1958年命名為核糖核蛋白體。它由幾十種蛋白質(zhì)和rRNA組成,RNA占3/5,蛋白質(zhì)占2/5,rRNA包括大、小兩個(gè)亞基,大亞基的RNA由23SrRNA真核(28)SrRNA和5.8SrRNA、5SrRNA組成,小亞基為16(真核18)SrRNA。最小的5SrRNA分子曾被用于分析微生物群落的組成。但該分子僅有120個(gè)左右bp,攜有的信息量有限,23S(28S)rRNA約3000(4500)bp雖然信息量大,但目前基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息較少,難以進(jìn)行分析研究。因此,分子量較大、攜帶信息量更多的16(18)SrRNA分子(約1500(2000)bp)獨(dú)秀于微生物生態(tài)的研究。16srDNA為16SrRNA的基因,在大多數(shù)原核生物中都具有多個(gè)拷貝,其基因序列由恒定可變區(qū)組成,可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異,恒定區(qū)序列基本保守。16srDNA序列進(jìn)化緩慢,具有高度的保守性,但在某些位點(diǎn)也會(huì)以不同的幾率發(fā)生突變,其序列的相似程度能區(qū)分和反映它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系,可以作為生物進(jìn)化史的分子鐘。16SrRNA/DNA技術(shù)能獲得傳統(tǒng)技術(shù)難以培養(yǎng)或鑒定的種群的DNA信息,較為真實(shí)地揭示微生物種類(lèi)和遺傳的多樣性,并可在同一時(shí)間研究多種微生物以及其動(dòng)態(tài)變化。有關(guān)18sRNA的序列分析或探針技術(shù)對(duì)厭氧真菌及原蟲(chóng)的分析近年來(lái)也有所涉及(Dore和Stahl等,1991;Wright,1997)。該分子的保守性太高,不能很好地確定目標(biāo)微生物的種類(lèi)及其在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)中的地位。1.2sacepactor公司的整體性研究由于16SrRNA在序列上的保守性,在某些細(xì)菌分類(lèi)鑒定中不能分辨型的差異,有些甚至不能分辨親緣關(guān)系相近的種間差異。例如雙歧桿菌菌種的鑒定。而16S到23S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列(internallytranscribedspacer,ITS,如圖1所示),進(jìn)化速度是16SrRNA的十倍(Nathalie.etal.),且該分子序列在原核生物中既普遍存在又在環(huán)境條件改變時(shí)相對(duì)穩(wěn)定。因此應(yīng)用于細(xì)菌的型間鑒定是較為理想的工具,可作為因16SrNA保守性造成的敏感性不足的補(bǔ)充。1993年,Gurtler利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)24個(gè)Clostridiumdiffi-cile的ITS序列處理,發(fā)現(xiàn)了16個(gè)不同長(zhǎng)度的核酸片段。Kostman等利用限制性酶切片段多態(tài)性分析手段對(duì)假胞菌(Pseudomonascepacia)的ITS進(jìn)行了分類(lèi)鑒定。原核生物基因組結(jié)構(gòu)一般不象真核生物那樣具有高度重復(fù)序列,而16SrDNA卻例外地以多拷貝形式存在.例如在大腸桿菌中有七個(gè)拷貝,在枯草桿菌中有十個(gè),而在分支桿菌中只有一個(gè)。由于ITS序列保守純度不高,在同一菌種亦可能有差異存在,因而影響了系統(tǒng)中種群豐度的估計(jì)。真核生物的rDNA為串聯(lián)重復(fù)序列,約100-200個(gè)拷貝,包括編碼28SRNA、5.8SRNA、5SRNA的基因,組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元(順?lè)醋?,產(chǎn)生一個(gè)前體RNA。在形成rRNA時(shí),第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-1:位于5.8S和18SrRNA之間),第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-2:位于5.8S和28SrRNA之間)被剪切。ITS區(qū)包括ITS-1和ITS-2,有時(shí)將ITS-1、5.8SrRNA和ITS-1統(tǒng)稱(chēng)為ITS,其結(jié)構(gòu)如圖2所示。ITS雖對(duì)rRNA的成熟有一定的作用,但最終不參加核糖體的形成,所受的選擇壓力較小,進(jìn)化速率較快,具有種間特異性和種內(nèi)保守性,可以作為分類(lèi)很好材料。利用其做序列分析或制作探針可能為厭氧真菌及原蟲(chóng)的研究提供更多的信息。Li和Heath(1992)及Li(1993)等利用ITS1序列研究真菌的進(jìn)化發(fā)育關(guān)系。ITS1序列在原蟲(chóng)遺傳多樣性的分析中業(yè)已成為較理想的分子標(biāo)記(林瑞慶等,2004;呂召宏等,2005;林瑞慶等,2006)。28S和18S之間的基因稱(chēng)為基因間區(qū)(intergenicsspacer,IGS,圖2),包括非編碼區(qū)(nontranscribedspacer,NTS)和外轉(zhuǎn)錄區(qū)(externallytranscribedspacer,ETS)。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位包括ETS,18S,ITS1,5.8S,ITS2和28S基因,重復(fù)單位由轉(zhuǎn)錄單位和NTS組成。順?lè)醋痈叨戎貜?fù),由于進(jìn)化的一致性,因此眾拷貝表現(xiàn)出高度保守(nrDNA的編碼區(qū)序列在不同綱、目間的同源率可達(dá)90%以上),序列差異主要表現(xiàn)在ITS,ETS及NTS等非編碼區(qū)。IGS中的ETS長(zhǎng)度在不同類(lèi)群間的變異較大,進(jìn)化速率與ITS相似,甚至更快,但其上游與高變的NTS相連,難以找到合適的通用引物擴(kuò)增該區(qū)域,一些作者認(rèn)為這一片段對(duì)那些僅靠ITS片段尚不能提供足夠信息的研究可給予一定的幫助;NTS是nrDNA中進(jìn)化最快的片段之一,因此推測(cè)在近緣類(lèi)群間的系統(tǒng)學(xué)研究、雜交研究及居群遺傳學(xué)研究上具有一定的潛力。雖IGS變異位點(diǎn)數(shù)要多于ITS序列,但從目前的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)看,提供的信息位點(diǎn)率比ITS要少。1.3srrna的分子標(biāo)記分析編碼酶的基因是分子微生物生態(tài)學(xué)中一個(gè)新的方向,這些基因比16SrRNA的基因具有更多的序列變化,或許是更好的區(qū)分密切相關(guān)但生態(tài)上不同的種群的分子標(biāo)記。2腫瘤胃微生物的主要分子技術(shù)2.1srdna序列同源性分析該技術(shù)是利用16SrDNA恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,可在界、門(mén)、綱、目、科、屬甚至在種等不同水平上設(shè)計(jì)特異性引物,結(jié)合PCR技術(shù),擴(kuò)增16SrDNA序列,再利用可變區(qū)序列的差異來(lái)進(jìn)行分類(lèi)鑒定。其主要步驟為:1)樣品中總DNA的提取;2)PCR擴(kuò)增16SrDNA序列;3)建立擴(kuò)增序列克隆文庫(kù);4)測(cè)序;5)序列的比較。PCR引物的設(shè)計(jì)是其基礎(chǔ)和關(guān)鍵。該引物序列應(yīng)與待擴(kuò)增的微生物類(lèi)群的16SrDNA全部匹配,但與其他類(lèi)群的16SrDNA有錯(cuò)配或盡可能少的全配。目前,據(jù)16SrDNA序列同源分析建立的專(zhuān)門(mén)的核糖體小亞基16S和18SrDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Theribosomaldatabaseproject,RDP)中,有用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的16S序列6205個(gè)。16SrDNA的同源性分析最適用于屬及屬以上的遠(yuǎn)緣關(guān)系。而對(duì)確定微生物種起決定作用的是DNA/DNA的同源性程度,一般的標(biāo)準(zhǔn)是70%以上同源為種的范圍。Ursing等進(jìn)行的16SrRNA序列和DNA/DNA同源性相關(guān)關(guān)系的研究表明:16SrRNA序列的相同性必須在99.8%以上才能達(dá)到70%以上的DNA/DNA的同源性。16SrRNA約為1500Kb,0.2%即相當(dāng)于有3個(gè)bp的差異,加上數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有數(shù)據(jù)的不完整性及讀數(shù)的誤差等,僅據(jù)16SrDNA/RNA序列鑒定種是不夠的,需結(jié)合其他方法加以驗(yàn)證。2.2rna探針的基本原理該技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種基于核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理,用特異性探針與待測(cè)樣品的核酸雜交的技術(shù)。可用16srDNA/rRNA分子設(shè)計(jì)探針,來(lái)檢測(cè)特定的微生物,甚至一些尚未成功培養(yǎng)的菌種。雜交反應(yīng)可以在樣品的核酸初始提取物或擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物內(nèi)以確證所獲得的序列的存在并估算其相對(duì)豐度?？梢罁?jù)微生物系統(tǒng)的16SrDNA/rRNA序列的信息,設(shè)計(jì)各級(jí)分類(lèi)水平上的探針,進(jìn)行平行的點(diǎn)漬或全細(xì)胞原位雜交時(shí),就可獲得微生物群落的種類(lèi)組成及其多樣性的相關(guān)的信息。獲得rRNA探針的基本途徑:①據(jù)已知的rRNA基因的序列直接設(shè)計(jì)探針;②用克隆、體內(nèi)或體外酶促轉(zhuǎn)錄等方法進(jìn)行復(fù)制rRNA序列的一部分,用作雜交探針,因事先不知道靶分子序列信息,利于發(fā)現(xiàn)新的微生物。2.2.1專(zhuān)一性探針和通用型探針?biāo)哂械南鄬?duì)豐度某一特定的16SrRNA相對(duì)于總16SrRNA的數(shù)量可通過(guò)以通用型和專(zhuān)一性的寡聚核苷酸探針?lè)謩e與直接從樣品中分離到的總核酸進(jìn)行點(diǎn)漬雜交而獲得,其相對(duì)豐度可以用放射性標(biāo)記的專(zhuān)一性探針和通用型探針各自與總核酸樣品雜合的量之比來(lái)表示。但是不同的物種細(xì)胞內(nèi)的核糖體的數(shù)量并不相同(介于103-05之間),甚至同一種細(xì)胞內(nèi)因?yàn)樗鼈兣c生長(zhǎng)速率不同其rRNA含量變化也很大(大于一個(gè)數(shù)量級(jí)),rRNA的相對(duì)豐度并不能直接轉(zhuǎn)換成相應(yīng)類(lèi)群的微生物細(xì)胞的數(shù)量,但rRNA的豐度能代表特定微生物種群的相對(duì)生理活性,對(duì)研究微生物生態(tài)具有一定的意義。2.2.2探針檢測(cè)原核生物的應(yīng)用生境樣品直接作原位雜交FISH,可獲得未知微生物的形態(tài)特征和豐度以及在樣品上的空間分布和動(dòng)態(tài)等信息,并可進(jìn)行有效定量。FISH技術(shù)利用帶有熒光標(biāo)記的探針與固定在玻片或纖維膜上的組織或細(xì)胞中特定的序列雜交,就像Northern、Southern印記一樣,但無(wú)需單獨(dú)分離出DNA或RNA,探測(cè)其中所具有的同源核酸序列,探測(cè)的靈敏度可達(dá)到10-20個(gè)mRNA拷貝/cell。FISH主要是用于研究原核生物。根據(jù)探針序列的不同,與相應(yīng)的靶核糖體結(jié)合,能鑒定到科、屬、種。由于能將單個(gè)細(xì)菌從復(fù)雜的菌群背景中檢測(cè)出來(lái),并可以定量。Gall和Pardue最早描述了FISH技術(shù)。Jain等采用特異性的探針對(duì)地下水中的細(xì)菌進(jìn)行FISH,研究細(xì)菌有關(guān)質(zhì)粒基因的存在和分布情況。Chang-ChaiNg等(2006)采用FISH,揭示臺(tái)灣太魯閣國(guó)家公園華發(fā)石中微生物群體的居群特征。2.2.3rna的基因序列特點(diǎn)①核酸回收的偏差。從生境樣品中毫無(wú)偏差地回收核酸是準(zhǔn)確地分析的前提?，F(xiàn)在常用的玻璃珠破碎法、十二烷酰-肌氨酸/蛋白酶K裂解法、反復(fù)凍溶法等提取方法尚無(wú)一種能保證回收到生境樣品中所有的DNA或RNA。②PCR的偏差。PCR對(duì)某些模板的擴(kuò)增具有優(yōu)先性,導(dǎo)致對(duì)rRNA基因自然豐度的估算會(huì)產(chǎn)生潛在的偏差,且隨PCR循環(huán)的增多變得嚴(yán)重;非適當(dāng)?shù)碾s交條件會(huì)導(dǎo)致引物的不準(zhǔn)確退火,有可能回收得到非目標(biāo)類(lèi)群的基因序列。③克隆步驟的偏差。來(lái)自不同有機(jī)體的rRNA基因片斷的克隆效率存在差異,不同的細(xì)菌染色體上的rRNA基因的操縱元的拷貝數(shù)并不一樣,因而據(jù)特定的rDNA克隆的相對(duì)豐度來(lái)估算其相應(yīng)種群的相對(duì)豐度會(huì)產(chǎn)生偏差。④探針雜交反應(yīng)的不確定性。所設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性探針可能不與靶序列起反應(yīng)而與其他序列發(fā)生交叉反應(yīng);rRNA分子還具有形成分子內(nèi)雙鏈區(qū)的趨勢(shì),因此探針穿過(guò)靶rRNA分子外部的細(xì)胞屏障后,還必須與互補(bǔ)的rRNA片斷競(jìng)爭(zhēng),才能與靶序列反應(yīng)。都導(dǎo)致了其反應(yīng)的不確定性。另外,若探針的靶分子數(shù)量太少,或探針與靶分子不能足夠靠近降低其可雜交性;FISH由于事先要根據(jù)已知種屬設(shè)計(jì)探針,不能檢測(cè)出樣品中的未知種屬。2.3利用分離技術(shù)鑒定微生物多樣性不同的微生物類(lèi)群在一定DNA操作工藝下,具有各自的16SrDNA/rRNA局部序列的特征圖譜,即遺傳指紋。依據(jù)獨(dú)特的分離技術(shù)如:變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、時(shí)間溫度梯度凝膠電泳(TTGE)、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)等獲得微生物群落多樣性的特征圖譜,可用來(lái)鑒定相應(yīng)的微生物遺傳多態(tài)性、混合微生物多樣性。適用于對(duì)各種生物反應(yīng)器中混合微生物多樣性及其動(dòng)態(tài)變化的研究。2.3.1凝膠電泳法自1993年Muyzer等用DGGE于微生物生態(tài)學(xué)研究以來(lái),已成為一項(xiàng)簡(jiǎn)便而有效的DNA擴(kuò)增片段檢測(cè)技術(shù)。PCR-DGGE的步驟為:核酸的提取,PCR,及DGGE分析PCR產(chǎn)物。其基本原理是:DGGE使用具有化學(xué)變性劑(尿素和甲酰胺)梯度的聚丙烯酰胺凝膠,有區(qū)別的解鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,解鏈時(shí)長(zhǎng)度相同而序列不同的DNA片斷就會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性——空間構(gòu)型變化——電泳速度下降——停留在各自相應(yīng)的變性劑梯度位置,形成一個(gè)凝膠帶圖案,該圖案是微生物群落中主要種類(lèi)的一個(gè)輪廓,每條帶代表一個(gè)特定的DNA序列,可以帶的數(shù)目和豐度表示的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。這樣可直接觀(guān)察瘤胃微生物多態(tài)性及動(dòng)態(tài)變化。并可通過(guò)對(duì)切下的帶進(jìn)行克隆序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落成員,對(duì)特殊的微生物進(jìn)一步分析。Lucacocolin等人用PCR-DGGE方法監(jiān)測(cè)了意大利香腸的自然發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。該試驗(yàn)打破了研究傳統(tǒng)發(fā)酵中由于不能被培養(yǎng)微生物無(wú)法分離而導(dǎo)致研究阻滯不前的狀況。JensWalter等人用PCR-DGGE法分析了人類(lèi)糞便中的乳酸菌(Lactobacillus)、微球菌(Pediococcus)等。該法提供了檢測(cè)腸道微生物菌群狀態(tài)及演替的簡(jiǎn)捷、可靠的方法。L.D.Rasmussen提取了湖底沉積層的微生物DNA,選取不同的引物,擴(kuò)增原生動(dòng)物Kinetoplastida的特異性24SrDNA,對(duì)其進(jìn)行DGGE分析,結(jié)果表明該法亦可以用于研究環(huán)境中的原生動(dòng)物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。Sylvester(2004)等用變性梯度凝膠電泳DGGE技術(shù)研究了原蟲(chóng)氮向小腸的流動(dòng)表明,等毛科原蟲(chóng)較內(nèi)毛目原蟲(chóng)的過(guò)瘤胃速度較慢,但大多數(shù)瘤胃原蟲(chóng)的過(guò)瘤胃速度相差不大。DGGE也有其局限性,如只能分離較小的片段,超過(guò)500bp分辨率降低;引物合成的成本高(引物的5′端有一個(gè)40～50bp左右的發(fā)卡結(jié)構(gòu));且DGGE在種水平上鑒定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是有限的,有時(shí)對(duì)得到的單條16SrDNA帶的克隆的序列分析還會(huì)出現(xiàn)一條帶中有不同的種類(lèi)(Yang和Crowley,2000);此外,該技術(shù)具有內(nèi)在的單一細(xì)菌種類(lèi)16SrDNA拷貝之間的異質(zhì)性問(wèn)題,可導(dǎo)致自然群落中微生物數(shù)量的過(guò)多估計(jì)。DGGE通常顯示群落中優(yōu)勢(shì)種類(lèi)的rDNA片段,小于1%種群難以被檢測(cè)到。因此,為了減少DGGE技術(shù)的缺陷,可使用雙梯度(結(jié)合聚丙烯酰胺梯度與變性劑梯度)DGGE分析增加分辨率(PetriR.等,2001);另應(yīng)與其它分子或微生物學(xué)方法結(jié)合以便更詳細(xì)、客觀(guān)的研究微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能。2.3.2非生物處理法1989年Orita首先使用,其檢測(cè)步驟為:核酸的提取,PCR,PCR產(chǎn)物變性,在非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SSCP的分離檢測(cè)。其原理是:將PCR產(chǎn)物變性成為單鏈(Single-strandDNA,ssDNA),由于單鏈的三維結(jié)構(gòu)受分子內(nèi)互作效應(yīng)影響,序列的不同引起三維結(jié)構(gòu)的不同,一個(gè)堿基的改變都將改變單鏈構(gòu)象,不同構(gòu)象的短鏈ssDNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠上的移動(dòng)速度不同,從而形成一個(gè)凝膠帶圖案。利用這一特點(diǎn)可將不同序列的單鏈分離(Delbesetal.,2001;Hayashietal.,1991;YapandMcgee,1994),該法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速,因而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè),近年來(lái)在居群微生物多樣性的分析上也有應(yīng)用。FrankSchwieger等人通過(guò)對(duì)根系微生物的分析表明PCR-SSCP可以很好的分析微生物群落的動(dòng)態(tài)變化,并應(yīng)用此方法研究了種植對(duì)土壤微生物群落的影響。SabinePeters等人用該法研究群落的演替和菌種的多樣性,并并同傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較指出PCR-SSCP方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力以及誤差大的干擾,適合對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和演替的分析。CelineDelbes等利用PCR-SSCP技術(shù),通過(guò)對(duì)廢水生物處理反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷細(xì)菌16SrRNA測(cè)序,分析了培養(yǎng)基改變對(duì)細(xì)菌群落的短期影響。FBattaglia-Brunet.等(2002)采用了PCR-SSCP研究了間歇式浸出含鈷黃鐵礦過(guò)程中細(xì)菌菌群之間的進(jìn)化關(guān)系。近年來(lái)SSCP較多的用于細(xì)菌群體特征(SchmalenbergerandTebbe,2003;Kowalchuk.etal.,2004),和不同的環(huán)境樣品細(xì)菌群體特征(JuncaandPieper,2004;Leclercetal.,2001;WenderothandAbraham,2005)。由于其簡(jiǎn)便省時(shí),經(jīng)濟(jì)成本有望成為一種常規(guī)的分析方法。但該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)及序列內(nèi)容,還需通過(guò)序列分析來(lái)確定;并且也隨著片段長(zhǎng)度的增大,檢出率降低(檢測(cè)范圍以不超過(guò)500bp為宜);同時(shí)檢出率還受堿基突變位置影響,影響單鏈構(gòu)象的突變易被檢出?；趓DNA分子的技術(shù)方法有很多,以上僅例舉幾種瘤胃微生物生態(tài)學(xué)常用的方法。3生物多樣性變化目前有眾多研究生境微生物的方法。諸多分子、生化等檢測(cè)手段如:群體水平的分類(lèi)、FISH、定量PCR、16SrRNA克隆測(cè)序、DGGE、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)以及免疫學(xué)檢測(cè)手段等都在生境微生物的研究中被應(yīng)用。在實(shí)際研究中往往需要據(jù)不同的研究目的而采用不同的方法組合策略以取長(zhǎng)補(bǔ)短。N.Ross等人采用SSCP+Biologmicroplates法(基于微生物群落對(duì)95種不同碳源的利用度來(lái)描述群落中微生物動(dòng)態(tài)變化)研究地下水中微生物的遺傳和代謝多樣性。A..Mark.Ibekwe等人研究薰劑對(duì)土壤微生物影響時(shí)采用PCR-DGGE+PLFA譜圖法組合。Chang-ChaiNg等采用16SrRNA克隆測(cè)序+FISH的組合策略,形成一套較為有效的微生物群體多樣性檢測(cè)分析技術(shù),較為客觀(guān)和真實(shí)地再現(xiàn)了臺(tái)灣太魯閣公園華發(fā)石中微生物群體的多樣性和結(jié)構(gòu)。還有克隆文庫(kù),測(cè)序+RFLP(Crump,etal.1999),克隆文庫(kù)、測(cè)序+分子雜交+DGGE(Moeseneder,etal.1999),克隆文庫(kù)、測(cè)序+分子雜交+傳統(tǒng)培養(yǎng)+T-RFLP(Dunbar.etal.,2000)等組合策略曾被應(yīng)用。尤其是培養(yǎng)與免培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合,可全面闡明微生物群體組成多樣性及其各區(qū)系或種屬乃至于特定微生物的功能角色與生態(tài)位。各種方法組合應(yīng)用,避免了由于方法原理本身所帶來(lái)的不可避免的偏差,提供更加全面的群落組成、變化方面的信息。Dunbar等(1997)認(rèn)為克隆文庫(kù)與其測(cè)序或RFLP的結(jié)合是最好的反映類(lèi)群多樣性與類(lèi)群比例的方法,但從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來(lái)看,若種群比例為10%,估計(jì)誤差將達(dá)到50%,若要使誤差降到10%,種群比例要在50%以上。而且,微生物中的弱勢(shì)群體,也很難在實(shí)驗(yàn)中被檢出。優(yōu)化互補(bǔ)的方法組合雖然在一定程度上能反映瘤胃微生物的類(lèi)群及變化特征信息,但對(duì)于復(fù)雜的瘤胃微生物體系而言,也只能略窺其冰山一角,其中還不乏偏頗。因此,對(duì)瘤胃微生物的研究及其研究方法的完善尚需進(jìn)行不懈的探索。4酶技術(shù)在腫瘤胃微生物研究中的應(yīng)用和前景4.1主要應(yīng)用4.1.1測(cè)序近地層文Tajima等構(gòu)建了16SrDNA基因產(chǎn)物接近全長(zhǎng)的(約1500kb)克隆測(cè)序文庫(kù);安登第構(gòu)建了牦牛瘤胃微生物宏基因組文庫(kù)及16SrDNA克隆測(cè)序文庫(kù)。4.1.2原蟲(chóng)種類(lèi)及其擴(kuò)增Koike等2003年通過(guò)16srDNA序列分析,研究附著于鴨茅和苜蓿干草莖的綿羊瘤胃微生物,發(fā)現(xiàn)測(cè)序的92個(gè)序列對(duì)應(yīng)的瘤胃細(xì)菌主要屬于噬纖維-黃桿菌-擬桿菌門(mén)(Cytophage-Flavobacter-Bacterioides)和低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌門(mén)(LowG+CGramPositiveBacteria,現(xiàn)在為厚壁菌門(mén)),分別占43%和44%。Kamati等(2003)用專(zhuān)一性的原蟲(chóng)引物PSSU-342f擴(kuò)增18SrDNA并結(jié)合克隆測(cè)序研究瘤胃原蟲(chóng),結(jié)果表明:其中所有克隆序列和GeneBank中的10個(gè)原蟲(chóng)序列有93-98%的序列同源性,且因日糧的不同其優(yōu)勢(shì)原蟲(chóng)種類(lèi)不同。Shin等(2004)用18sRNA片段測(cè)序技術(shù)分析瘤胃原蟲(chóng)結(jié)果表明:在瘤胃液分離出的可識(shí)別克隆片段中,有69.6%為內(nèi)毛蟲(chóng);31.4%為貧毛蟲(chóng);同時(shí)30.4%的克隆片段是GeneBank沒(méi)有的。4.1.3菌株進(jìn)化分析利用克隆測(cè)序或分子標(biāo)記等手段研究微生物遺傳的多樣性,通過(guò)相應(yīng)的分子生物學(xué)軟件,比對(duì)所測(cè)得序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列,分析其進(jìn)化上的關(guān)系,計(jì)算聚類(lèi)相似值及進(jìn)化距離,根據(jù)相似性矩陣?yán)L制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),可分析菌株系統(tǒng)發(fā)育地位。如對(duì)降解聚氯聯(lián)苯(Polychlor