生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)一、裝柱及標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子篩層析：把柱子固定在夾子上，打開下面的蓋，用取液器勻速加入介質(zhì)。保證介質(zhì)均勻沉淀，且要緩慢加入，防止產(chǎn)生氣泡。待介質(zhì)完全沉降打開柱的上蓋，剪一與柱內(nèi)徑大小一致的圓形濾紙片放入柱中，沉淀于介質(zhì)表面。液體接近界面時(shí)加入3ml超純水，同時(shí)在層析杯中加入100ml超純水，連接泵洗柱15min，同時(shí)配制平衡液200mL（20mmolTris-HCl,pH8.0;20mmolNaCl）。待液體接近界面時(shí)，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到層析杯中），調(diào)節(jié)流速，控制滴速為3ml/10min（一分鐘約6-7滴）。平衡柱過中午。實(shí)驗(yàn)材料：牛血清蛋白、糜蛋白酶二者比例為2:1溶于20mmolTris-HCl，pH8.0;20mmolNaCl（教師統(tǒng)一配制）。緩慢向柱中加入樣品（4ml）打開層析柱上下端，使樣品靠重力流出。當(dāng)樣品接近界面時(shí)在柱中加入3ml上樣緩沖液（即平衡液），連接泵，調(diào)T=100A(0.5A)=0，開啟記錄儀，同時(shí)配制100ml0.1MNacl。待兩個(gè)峰都出來后，把層析杯中的液體換為0.1MNacl洗柱20min，再用超純水洗柱30min，封柱，關(guān)機(jī)。。實(shí)驗(yàn)二BAP的誘導(dǎo)表達(dá)在5ml培養(yǎng)基中加入Amp2.5μl（母液為100mg/ml）和10μl菌液。在搖床上37℃130轉(zhuǎn)過夜預(yù)培養(yǎng)。取2.5ml菌液加入50ml含有Amp(25μl)的LB培養(yǎng)基中（1:20擴(kuò)培）。37℃恒溫?fù)u床，180-200rpm培養(yǎng)40-60min左右。測(cè)OD600,使其值達(dá)到0.5-0.7。加入終濃度為1mM的IPTG(500μl)進(jìn)行外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)。于室溫誘導(dǎo)4-5小時(shí)。取出后進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎，留1ml破碎前菌液處理后進(jìn)行western及PAGE，其余放入冰箱于4度保存。實(shí)驗(yàn)三BAP的親和層析純化破碎細(xì)菌鹽酸胍破碎1.100ml誘導(dǎo)后的菌液分別放于大離心管中，配平，5000rpm離心15min。去上清。2.加入1/10體積PH8.0磷酸鈉緩沖液（20mM）重懸后5000rpm離心10min，去上清。3.在沉淀中加入1/10體積的6M的鹽酸胍溶液（注：鹽酸胍要用20mM的磷酸鈉緩沖液溶解）。用玻動(dòng)棒攪開后在304.分裝于1.5ml離心管中，12000rpm離心10imn，取上清，上樣（留100μl上樣前的蛋白樣品）超聲波破碎誘導(dǎo)后的菌體于大離心管中，5000rpm離心15min，棄上清。加入1/10體積的破碎緩沖液洗滌。離心15min5000rpm去上清，加入破碎緩沖液及終濃度為50μl/5ml的溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配，母液100mg/ml）。30℃溫浴15min。（離心時(shí)調(diào)好30℃的水浴搖床）。在冰浴條件下，60%功率超聲處理5min（具體做法是每管中0.5ml樣品，每五管一組，放于冰浴中連續(xù)處理，每管4秒，再重復(fù)，直到處理5min為止。再用40%功率超聲處理5min）。超聲要求a將菌液處理至清亮；b始終保持低溫環(huán)境；c避免出現(xiàn)黑色沉淀。將超聲處理后的樣品于4℃2000rpm離心10min，沉淀為細(xì)胞碎片棄去。上清再于4℃12000rpm離心10min。上清為可溶性蛋白，沉淀為包涵體。（包涵體留樣1ml，可溶性蛋白留樣100μl）三、上親和柱1、裝柱（此步驟在破碎細(xì)菌時(shí)同時(shí)做）每柱中裝1.5ml的介質(zhì)、乙醇混合液（混合后加）。打開底下的帽，待液體滴至界面時(shí)加入5柱體積約4ml的超純水洗5遍，然后加入5柱體積的stortingbuffer，5遍平衡柱。2、上樣待液體接近界面時(shí)，用取液器將可溶性蛋白樣品加入親和柱。（鹽酸胍破碎）?？缮偕弦恍悠罚鶕?jù)流速確定上樣量。超聲波破碎的要全部上樣。并且根據(jù)流速可以上2-3次。3、臨洗待樣品流到界面時(shí)，用含10mM咪唑的淋洗液洗10柱體積。（注意：咪唑用破碎緩沖液稀釋）4、洗脫用3ml含有300mM咪唑的洗脫液洗脫，并且用eppendorf管收集每管500μl。（留樣100μl）其余的洗脫樣品用于離子交換層析。實(shí)驗(yàn)四BAP的分子篩排阻層析平衡柱二、上樣（杯中預(yù)先加入100ml起始緩沖液）親和層析的樣品第2、3、4管分別取400μl混勻于1.5ml離心管中上柱，重力使之滲入柱子。樣品接近界面時(shí)，加入1ml起始緩沖液。打開泵開始收集（加樣時(shí)即打開讀紙器），在峰頂處留樣測(cè)定酶活。關(guān)讀紙機(jī)。然后用20ml0.1MNacl的處理柱子。洗柱，用超純水洗30min左右。實(shí)驗(yàn)五SDS樣品處理（在配完濃縮膠后靜置30min時(shí)，每組由一個(gè)人處理即可）包涵體處理：在留樣的沉淀中加入500μl8M的尿素，搖勻。取20μl于1.5ml離心管中，再加入50μl上樣緩沖液，于100℃沸水中煮沸5min。菌體處理：將留樣的1ml菌體于12000rpm離心1min，用濾紙吸干殘液，用100μl上樣緩沖液重懸菌體，100℃沸水中煮沸5min。親和層析樣品處理：取親和層析樣品，2和3號(hào)管各20μl于1.5ml離心管中，再加入20μl上樣緩沖液，于100℃沸水中煮沸5min。待樣品冷卻后12000rpm離心5min。二、清洗安裝清洗電泳槽，玻璃板（用海綿塊洗），膠條等電泳裝置，然后用衛(wèi)生紙輕輕吸水晾干。組裝玻璃板（凹面向外），封膠條，要貼緊玻璃板，膠條下端要平直，并且膠條始終要自然彈性范圍不要用力拽。每組裝好后讓老師檢查后再去灌膠。三、配分離膠每組準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯，按照實(shí)驗(yàn)講義的配方配。12%的分離膠，混勻后立即用取液器加入玻璃板中，加至紅線處。然后加入1ml的超純水。靜置30min。待膠凝固后傾斜倒出超純水。用濾紙吸干殘液。四、配濃縮膠配5%濃縮膠，混勻后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至沒過柱子與玻璃板凹面相平。靜置30min。五、上樣前準(zhǔn)備待濃縮膠凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去膠條，使玻璃板凹面向內(nèi)重新組裝，然后向內(nèi)外槽加入電極緩沖液（內(nèi)槽一定要加滿）。六、點(diǎn)樣按順序依次點(diǎn)樣，兩塊膠一塊做SDS染色（普通Marker），另一塊做western雜交（點(diǎn)預(yù)染Marker）。Marker要提前處理。七、電泳將電泳裝置與電泳電源連接（注意正負(fù)極）。調(diào)電壓60V。待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，換成90V電壓，直到溴酚藍(lán)前沿跑出膠，再過半小時(shí)，關(guān)閉電源停止電泳。八、膠的處理電泳完畢后，卸下玻璃板，小心撬開。用手術(shù)刀切去濃縮膠。將點(diǎn)有普通Marker的膠浸泡在染色液中。染色→脫色→水洗（過夜）。預(yù)染Marker的膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。實(shí)驗(yàn)六Western印跡清洗轉(zhuǎn)移電泳槽等裝置。蒸餾水漂洗點(diǎn)有預(yù)染Marker的膠。然后浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。戴上手套用鑷子夾住PVDF膜。先在甲醇中處理15秒（嚴(yán)格計(jì)時(shí)）。然后放入蒸餾水槽中漂洗一下，最后放于盛有轉(zhuǎn)移緩沖液的盆中平衡15min。同時(shí)將4片濾紙2塊海綿浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。盡量用玻璃棒趕去海綿中的氣泡（否則易短路）。然后按照陰極黑板——海綿墊——2層濾紙——凝膠——PVDF膜——2層濾紙——海綿墊——陽(yáng)極紅板的順序裝。80mA恒流下在轉(zhuǎn)移電泳槽中電泳2.5-3小時(shí)。然后卸去裝置。取出PVDF膜放于干燥濾紙上片刻，但不要吸干膜。滅菌去離子水中沖洗。將PVDF膜放入玻璃平皿中加入封閉液，在搖床上封閉2小時(shí)。封閉液（5ml）TBS（5ml）脫脂奶粉（0.25g）。封閉2小時(shí)后取出PVDF膜，在1*TBS中漂洗2次后放入平皿中加入一抗封閉液（一抗1:2000）。每組10ml，過夜。稀釋稀釋10×TBS6ml60ml1×TBS60ml一抗封閉液比溫30μl一抗30μl奶粉3g在脫色搖床上搖10min，然后4℃過夜孵育。取出膜后在1×TBS中漂洗2次。每次10min。放入二抗封閉液中（二抗1:1000）。每組10ml，孵育1.5-2小時(shí)。配制2000ml1×TBS倒入5個(gè)瓷盆中，取一片BAB溶于37℃預(yù)熱的10m超純水。用玻璃棒攪拌至完全溶解。加入20μl30%的雙氧水搖勻。倒入平皿中。將平皿放于抽屜暗處顯色5min。取出膜用滅菌去離子水漂洗終止反應(yīng)，然后用清水沖洗。酶活力測(cè)定步驟取5只1.5mlEP管標(biāo)號(hào)1—5，向1#管中加入1ml超純水。2#加50μl總蛋白。3#、4#分別加入50μl親和層析2號(hào)和3號(hào)樣品。5#中加入1μlBAP和1ml滅菌處理過的超純水（先加水，后加BAP標(biāo)準(zhǔn)品）。2#、3#、4#、5#管分別加超純水稀釋至1ml。取5只試管，洗凈后標(biāo)號(hào)1—5.每個(gè)試管中加入2ml底物溶液，再把相應(yīng)編號(hào)的EP管中的溶液加入試管中。用力混勻。在大燒杯中盛入適量預(yù)熱37℃預(yù)熱的水。將試管放入燒杯中，在恒溫37℃水浴中反應(yīng)5min。在每支試管中加入250μl1MNaOH溶液終止反應(yīng)。在可見分光光度計(jì)測(cè)量OD410，計(jì)算3次平均值。計(jì)算酶活力。計(jì)算：（1）酶活力單位數(shù)×0.45U（標(biāo)準(zhǔn)品的活力單位）OD410樣品×0.45U（標(biāo)準(zhǔn)品的活力單位）OD410標(biāo)準(zhǔn)品×稀釋倍數(shù)（2）酶的比活力=酶活力單位數(shù)/mg蛋白（3）蛋白濃度（mg/ml）=1.45OD280（×稀釋倍數(shù)）—0