生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題

第一章緒論

第一節(jié)生物技術(shù)的發(fā)展史

1、生物技術(shù)：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有與其性狀的新物種

或新品系，并與工程結(jié)合，利用這樣的新物種進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會提供商品服務(wù)的一個綜合性

技術(shù)體系。它的范疇：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程?；蚬こ淌巧?/p>

技術(shù)的核心。P1

2、蛋白質(zhì)工程一一第二代基因工程；海洋生物技術(shù)——第三代生物技術(shù)P1

3、生物技術(shù)發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、現(xiàn)代（DNA重組）P3

1974年，Boyer和Cohen建立了DNA重組技術(shù)

1975年，Koher和Milstein建立了單克隆抗體技術(shù)

1982年，第一個基因工程藥物重組人胰島素被批準(zhǔn)上市

1989年，我國第一個基因工程藥物干擾素批準(zhǔn)上市

2003年，中國的重組腺病毒-p53注射液成為石階上第一個正式批準(zhǔn)的基因治療藥物。

第二節(jié)生物技術(shù)藥物

1、生物技術(shù)制藥：生物技術(shù)制藥：采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、

植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。P4

2、生物技術(shù)藥物：采用DNA重組技術(shù)活其他生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。它與天然生

化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品共同歸為生物藥物。

3、現(xiàn)代生物藥物分為4類：重組DNA技術(shù)制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑；基因藥物;

天然藥物：合成與部分合成藥物。

4、生物藥物按用途分為：治療藥物；預(yù)防藥物；診斷藥物。

5、生物技術(shù)藥物的特征：

（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜；（2）具有種屬特異性；（3）治療針對性強、療效高；（4）穩(wěn)定性差

（5）基因穩(wěn)定性；（6）免疫原性；（7）體內(nèi)半衰期短；（8）受體效應(yīng)；（9）多效性和網(wǎng)絡(luò)

性效應(yīng)；（10）檢驗的特殊性。

第三節(jié)生物技術(shù)制藥

1、生物技術(shù)制藥的特征：高技術(shù)、高投入、長周期、高風(fēng)險、高收益。P5

2、生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用有哪些？P7

（1）基因工程制藥：①開發(fā)基因工程藥物，如干擾素（IFN）、紅細(xì)胞生成素（EP0）等②基

因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗體，它可以作為導(dǎo)向藥物的載體④基因診斷與

基因治療⑤應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型⑥應(yīng)用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的

微生物藥物⑦改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝⑧利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物。

（2）細(xì)胞工程制藥①單克隆抗體技術(shù)②動物細(xì)胞培養(yǎng)③植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物。

（3）酶工程制藥：酶與細(xì)胞的固定化及酶轉(zhuǎn)化制藥

（4）發(fā)酵工程制藥：發(fā)酵工藝改進(jìn)、新藥研制、菌種改造。

第二章基因工程制藥

第一節(jié)概述（略）

第二節(jié)基因工程藥物的生產(chǎn)過程P15

1、基因工程技術(shù)：將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或

細(xì)胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

2、基因工程藥物制造的主要程序（過程）（重點和后面幾節(jié)聯(lián)系起來）

（1）目的基因的克?。ǚ蛛x目的基因）：通過逆轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、化學(xué)合成方

法來制備cDNA,再通過核酸探針雜交或免疫反應(yīng)來篩選目的基因（2）目的基因與載體連接構(gòu)建

DNA重組體：通過限制性內(nèi)切酶DNA連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的相關(guān)克隆位點，常

用的載體有質(zhì)粒載體和噬菌體載體（3）將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌：常用的宿主菌有

大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處于感受態(tài)，再通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式把重組DNA導(dǎo)入宿主菌，

以構(gòu)建工程菌（4）工程菌發(fā)酵：提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、反應(yīng)器、控制好發(fā)酵過程中的各種參數(shù)，

如溫度、PH、溶氧等，并通過升溫來誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)（5）目的基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化：通過固

液分離、初步純化、高度純化、成品加工來制備產(chǎn)品：若是胞內(nèi)產(chǎn)物需要細(xì)胞破碎，若是包涵體

則需要變性和復(fù)性（6）產(chǎn)品的檢驗：檢測產(chǎn)品的質(zhì)量和性能。

第三節(jié)目的基因的獲得

1、利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽需要得到其基因，制備目的基因常用的方法有哪些？P16

（1）逆轉(zhuǎn)錄法

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的到cDNA,構(gòu)建cDNA文庫，從cDNA文庫中篩選目的基因。由于RNA

轉(zhuǎn)錄加工過程中，內(nèi)含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文庫中無內(nèi)含子，適于在原核系統(tǒng)中表

達(dá)。但是，cDNA只包含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因部分，缺少有關(guān)的調(diào)控序列，因此在原核系統(tǒng)中表達(dá)，

還需要根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)，配以相應(yīng)的調(diào)控序列。

（2）利用反轉(zhuǎn)錄-聚合前鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備基因

（3）化學(xué)合成法：只適用于克隆小分子肽的基因

2、利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過程P16

（1）mRNA的純化：從表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總RNA,用寡聚脫氧胸背（dT）纖維素柱從總

RNA中提取純化mRNA。

（2）cDNA的合成：以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再用DNA聚合酶合成cDNA

的雙鏈。

（3）cDNA克?。豪煤线m的連接方法，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到合適的載體中。

（4）構(gòu)建cDNA文庫：將cDNA與載體連接的重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，產(chǎn)生的克隆群體為cDNA

文庫。

（5）從cDNA文庫中篩選目的基因：得到cDNA文庫后，通常采用核酸探針雜交法和免疫反應(yīng)鑒

定法從數(shù)以萬計的DNA片段中篩選出目的基因。

3、載體分為：表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。P17

第四節(jié)基因表達(dá)

1、基因表達(dá)：指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。P20

2、基因高效表達(dá)研究：指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動，即剪切下外源基因片段，拼接到

另一個基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。P20

3、基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞分為兩大類：P21

第一類為原核細(xì)胞（常用的有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等）；

⑴大腸桿菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系）：表達(dá)基因產(chǎn)物形式多樣，大

吻桿菌中的表達(dá)不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常

形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N

端多余一個蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。

⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強的胞外蛋

白酶對產(chǎn)物降解。

⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達(dá)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。

第二類為真核細(xì)胞（常用的真核微生物有酵母、絲狀真菌等）

⑴酵母：酵母菌是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍

體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)

⑵絲狀真菌：分泌能力強，能正確進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。

4、目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母。P22

5、大腸桿菌基因表達(dá)載體P23

（1）pBV220系統(tǒng)

PBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體，其組成：①來源于pUC8多克隆位點；②核糖體rrnB基因終

止信號；③pBR322第4225?3735位；④pUC18第2066-680位；⑤入噬菌體clts857抑制子基

因及PR啟動子；⑥pRC23的PL啟動子及SD序列

（2）pET系統(tǒng)

6、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素P22

外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個細(xì)胞產(chǎn)量取決于：

（1）外源基因的劑量：一般來說細(xì)菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的表達(dá)產(chǎn)物也增加。

（2）外源基因的表達(dá)效率

①啟動子的強弱：啟動子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因表達(dá)的因素。需要尋找強的啟動子。

②核糖體結(jié)合位點的有效性：大腸桿菌核糖體結(jié)合位點對真核基因在細(xì)菌中的高效表達(dá)是卜分

重要的。

③SD序列和起始密碼ATG的間距：表達(dá)非融合蛋白的關(guān)鍵是原核SD序列和真核起始密碼ATG

之間的距離，距離過長過短都影響真核基因的表達(dá)。

④密碼子組成：應(yīng)選擇使用大腸桿菌偏愛的密碼子。

（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：

（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷：必須使宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷不至過重，乂能高效表達(dá)出外源基因產(chǎn)物。

（5）工程菌的培養(yǎng)條件

外源基因的高水平表達(dá)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關(guān)系，而且與其所處的

環(huán)境條件息息相關(guān)，必須進(jìn)行優(yōu)化。

7、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式P26

⑴以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因

以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。

優(yōu)點：操作簡便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達(dá)；

缺點：只能作抗原用。

⑵以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因

非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始,在其氨基端不含

細(xì)菌多肽序列。

優(yōu)點：保持原有蛋白活性；

缺點：易被蛋白醐破壞。

⑶分泌型表達(dá)藥物基因（外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游）

優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；

缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割。

8、載體相關(guān)定義

載體：在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的…種能自我復(fù)制的

DNA分子。

克隆載體：從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛?xì)胞中獲取的DNA作為載體，在其上插入合適大小的外源

DNA片段，將重組后的載體引入到宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中大量繁殖。

表達(dá)載體：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基

因能夠表達(dá)的載體。

穿梭載體：指含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體（例如既能在

原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體）。

9、載體的復(fù)制系列可分四類：P27

（1）Yep類（酵母附加體質(zhì)粒）（2）YRp類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）

（3）YCp類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（4）Yip類（酵母整合型質(zhì)粒）

10、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素

⑴外源基因的拷貝數(shù)

⑵外源基因的表達(dá)效率：①啟動子②分泌信號的效率③終止序列的影響

⑶外源蛋白的糖基化

⑷宿主菌株的影響：①菌體生長力強②菌體內(nèi)源蛋白醐要較弱③菌體性能穩(wěn)定④分泌能力強

11、精確表達(dá)載體P28

酵母載體有兩類：普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體。

精確表達(dá)載體:要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點，以利于接入外源基因,

并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基

酸的克隆載體。

第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點

1、碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)

生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH,可減少乙酸的抑制作用；

P31

第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性

1、質(zhì)粒不穩(wěn)定分為那兩類？P32

工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌在分裂時出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。與含質(zhì)粒菌

產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌比數(shù)率差異的大小有關(guān)

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。

基

2,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法P33

（1）選擇合適的宿主菌：遺傳穩(wěn)定（2）選擇合適的載體：高拷貝數(shù)；（3）選擇壓力：如加抗

生素提高穩(wěn)定性；（4）分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長至一定密度；再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)（5）

控制培養(yǎng)條件（6）固定化

第八節(jié)重組工程菌的培養(yǎng)

1、基因工程菌的培養(yǎng)方式P36

（D分批培養(yǎng)

（2）補料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過一段時間后間歇或連續(xù)地補加新鮮

培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的方法。

（3）連續(xù)培養(yǎng)

（4）透析培養(yǎng)

（5）固定化培養(yǎng)

2、基因工程菌的培養(yǎng)工藝P37

（1）培養(yǎng)基的影響（2）接種量的影響（3）溫度的影響（4）溶氧量的影響（5）誘導(dǎo)時機的

影響（6）誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響：?般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。

（7）pH的影響：生長pH在6.8?7.4左右，后期外源蛋白的表達(dá)其最佳pH為6.0?6.5。

第九節(jié)高密度發(fā)酵

1、什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法實現(xiàn)高密度發(fā)酵？P41

(1)高密度發(fā)酵：一個相對概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論

上的最高值可達(dá)200gDCW/L.

(2)影響高密度發(fā)酵的因素：培養(yǎng)基；溶氧濃度；pH；溫度；代謝副產(chǎn)物

(3)實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法P43

①發(fā)酵條件的改進(jìn)

a.培養(yǎng)基的選擇(普遍采用6g/L的甘油為碳源)；b.建立流加式培養(yǎng)的方式；c.提高供氧能力

②構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌

a.阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑；b.對碳代謝流進(jìn)行分流；c.限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流；d.

引入血紅蛋白基因

③構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

第十節(jié)基因工程藥物的分離純化

1、表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)，它的制得具有以下特點：P46

(1)表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；(2)含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；(3)表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，

易失活變性；(4)表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不?、活性各異；(5)對其質(zhì)量要求純度高、無

菌、無熱原。

2、分離純化的基本過程

胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物

細(xì)胞破碎

固液分離一*^縮f初步分離一^度純北L制劑T產(chǎn)品

包W不細(xì)胞碎匕分離

變&

復(fù)性

若是論述題最好對過程進(jìn)行一定的介紹

3、建立分離純化工藝的根據(jù)P46

(1)含目的產(chǎn)物的起始料的特點

基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及

其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。

(2)物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。

(3)目的產(chǎn)物特性。

(4)產(chǎn)品質(zhì)量的要求

4、細(xì)胞破碎與固液分離

⑴細(xì)胞收集：離心法、膜分離法。

⑵細(xì)胞破碎：機械破碎法、非機械破碎法；物理法、化學(xué)法、生物法

⑶固液分離：離心、膜過濾、雙水相萃取

5、細(xì)胞破碎的方法；P47

(1)物理方法：勻漿法、珠磨法、超聲波法

(2)化學(xué)法：滲透沖擊法(高滲+低滲)、增溶法(表面活性劑等)

(3)生物法：酶溶法

6,分離純化常用的色譜分離方法有那些？P50

分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)

點是該法具有多種多樣的分離機制、設(shè)備簡單、便于自動化捽制和分離過程中無發(fā)熱等有害效

應(yīng)。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高壓液相

色譜等。

(1)離子交換層析P51

離子交換介質(zhì)由三部分構(gòu)成：(1)不溶性高分子聚合物一載體；(2)共價鍵結(jié)合于載體上一

活性基團或功能集團(3)與活性基團帶相反電荷--平衡離子或反離子(決定是陰離子交換樹脂

還是陽離子交換樹脂)如：酸性陽離子交換樹脂R-SO汨

蛋白質(zhì)的等電點和表面電荷的分布主要影響離子交換的性能。

它由平衡、上樣、洗脫(分為梯度洗脫和階段洗脫2種)、再生4個主要步界構(gòu)成。

(2)疏水層析P54

利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互

作用力增強。流動相為PH6?8鹽水溶液。常用的介質(zhì)是多聚糖(如瓊脂糖)和硅膠。

(3)親和層析P4756

親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體

與激素、酶與底物之間的作用。洗脫時分為特異性洗脫和非特異性洗脫。

(4)凝膠過濾層析P59

凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，

向大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動，大分子量物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。利用這種移動差

別可使大分子與小分子分開。

7、用于分離純化的技術(shù)應(yīng)滿足那些要求？P62

(1)技術(shù)條件溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。

(2)選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將H的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高純化倍數(shù)。

(3)收率要高。

(4)兩個技術(shù)之間不需要對物料加以處理或調(diào)整，這樣可以減少工藝步驟。

(5)整個分離純化過程要快速，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。

第十一節(jié)變性蛋白的復(fù)性

1、外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成P63

2、包涵體：指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。

3、包涵體的分離和溶解P63

(1)包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑(胭或鹽酸弧)、去

垢劑(TritonX-100)、脫氧膽酸鈉洗滌。

(2)包涵體溶解：般用強的變性劑如服(6-8M)、鹽酸胭(6M),或用去垢劑，如SDS＞正十

六烷基三甲基嵌氯化物等，溶解涵體蛋白質(zhì)。

(3)包涵體復(fù)性：稀釋復(fù)性和透析復(fù)性；含二硫鍵的蛋白的復(fù)性；封閉蛋白的疏水菠促進(jìn)復(fù)性；

凝膠過濾層析復(fù)性；小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性；分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性；人工分子伴侶的

復(fù)性

第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制

1、由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時，常作那些項H分析？P68

(1)肽圖分析

肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)后，對生成的肽段進(jìn)行的分離分析。它是一種可檢測

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法，該技術(shù)靈敏高效的特點使其成為對基因工程藥物的

分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評價和驗證的首選方法。

(2)氨基酸成分分析

在氨基酸成分分析中，一般含50個左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是接近理論值的，即

與序列分析結(jié)果一致。

(3)部分氨基酸序列分析

部分氨基酸序列分析(N端15個氨基酸)可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。

(4)重組蛋白質(zhì)的濃度測定和分子量測定

蛋白質(zhì)濃度測定方法主要有凱氏定氮法、雙縮胭法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外法等。

蛋白質(zhì)分子量測定最常用的方法有凝膠過濾法和SDS法，凝膠過濾法是測定完整的蛋白質(zhì)

分子量，而SDS法測定的是蛋白質(zhì)亞基的分子量。

(5)蛋白質(zhì)二硫鍵分析

二硫鍵和航基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，基因工程藥物產(chǎn)品的硫-硫鍵是否正確配對是一個

重要問題。

第三章動物細(xì)胞制藥

第一節(jié)概述

細(xì)胞工程：是指以細(xì)胞為對象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改

造生物遺傳特性，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。P79

第二節(jié)動物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(重點)

1、離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞分為那些類型？P81

動物細(xì)胞適應(yīng)功能，形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類：貼壁細(xì)胞；懸浮細(xì)胞

(1)貼壁細(xì)胞

生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。

兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型

(2)懸浮細(xì)胞：生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細(xì)胞。

(3)兼性貼壁細(xì)胞：生長不嚴(yán)格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。

2、什么是接觸抑制現(xiàn)象？P84

當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，即每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時，

細(xì)胞就停止增殖。此時若能保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活相當(dāng)一段時間，但細(xì)胞密度不再

增加，所以該現(xiàn)象又稱之謂接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)

象隨之消失，細(xì)胞可多層生長。細(xì)胞密度也就可大大增加。

3、動物細(xì)胞的生理特點P83

(1)細(xì)胞的分裂周期長

動物細(xì)胞分裂所需的時間一般為12?48h,它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，

不同部位的細(xì)胞其所需的時間也不同。周期=間期+分裂期間期(G1+SW2)分裂期(M)

(2)細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象

(3)正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的

(4)動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感。動物細(xì)胞對各種物理化學(xué)因素，如滲透壓，pH,離子濃度，

剪切力，微量元素等的變化耐受力很弱。

(5)動物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高

氨基酸、維生素，多種無機鹽和微量元素，細(xì)胞生長因子、貼壁因子。

(6)動物細(xì)胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同

動物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成除了在游離的核糖體上進(jìn)行外，還在與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上結(jié)合的核糖

體上進(jìn)行。(游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌

的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。)

3、動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥物的特點；P85

(1)優(yōu)點：產(chǎn)品多分泌在胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，因

此與天然產(chǎn)品更一致，適于臨床

(2)缺點：培養(yǎng)條件要求高，成本貴，產(chǎn)量低

第三節(jié)生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得

1、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的種類及其特點P86

用于生產(chǎn)的動物細(xì)胞有三類，即原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系、以及可無限期傳代

的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，以及用這些細(xì)胞進(jìn)行融合和重組的工程細(xì)胞。

(1)原代細(xì)胞

原代細(xì)胞是直接取自動物組織、器官，經(jīng)過分碎，消化而獲得的細(xì)胞懸液。用得最多的是雞胚細(xì)

胞，原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，以及血液的淋巴細(xì)胞。

(2)二倍體細(xì)胞系

原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選，并純化出某種具有一定特

征的細(xì)胞株。該細(xì)胞株仍具備“正?！奔?xì)胞的特點，一般均從動物的胚胎組織中獲取。

(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞

這類細(xì)胞是通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，它常常由于染色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正

?！奔?xì)胞的特點，而獲得了無限增殖的能力。由于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有無限生命力，而且常常倍增時

間較短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

(4)其他：融合細(xì)胞系(物理法如高壓電場和化學(xué)法如仙臺病毒、聚乙二醇)和重組工程細(xì)胞系

2、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建，使用的載體有兩類：(1)病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆

轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒；(2)質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體P88

3、重組DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞的常用方法：融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法，最常用磷酸鈣沉淀

法、電穿孔法P89

4、生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個細(xì)胞庫：原始細(xì)胞庫(MCB)、生產(chǎn)用細(xì)胞庫(MWCB)或工作

細(xì)胞庫(WCB)P91

第四節(jié)動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基

1、動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件P92

(1)器材的清洗和消毒

①器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、沖洗②器材的消毒滅菌：物理消毒/化學(xué)消毒

(2)水質(zhì)：電阻值大于18M。，去熱原。

(3)pH:7.2—7.4

(4)滲透壓:290?300mosm/kg

(5)溫度:哺乳動物37±0.5C；

(6)空氣:氧的飽和質(zhì)60%,氧分壓4~0.7kPa

2、培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成P95

動物細(xì)胞培養(yǎng)基大致可以分成三類：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。

(1)天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等，成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定

(2)合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應(yīng)，DME、MEM,DMEM等(第一個合成培養(yǎng)基是199培養(yǎng)基；

①氨基酸：12種必需氨基酸+谷氨酰胺②維生素：形成輔基和輔醐③糖類：能源，用葡萄糖和谷

氨酰胺④無機鹽：維持滲透壓⑤其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽⑥添加5%?10%小

牛血清：作用是提供生長因子和激素；提供貼附因子和伸展因子：提供結(jié)合蛋白；提供必需脂肪

酸和微量元素

（3）無血清培養(yǎng)基：

無血清培基的優(yōu)點如下：①提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批間差異的影響。②

減少了由血清帶來病毒、霉菌和支原體等微生物污染的危險。③供應(yīng)充足，穩(wěn)定。④細(xì)胞產(chǎn)品

易于純化。⑤避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性。⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定

的干擾，便于對實驗結(jié)果的分析:（簡答題時候可以不寫優(yōu)點）

無血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長因子和激素（胰島素）；結(jié)合蛋白（跳傳遞蛋白和白蛋白）；

貼附因子和伸展因子（膠原等）；有利細(xì)胞生長的因子和元素（谷胱甘肽）

第五節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

1、細(xì)胞傳代；P101

原代培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞匯合以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生成空間不足或由于細(xì)胞

密度過大引起營養(yǎng)枯竭，都將影響細(xì)胞的生長，這一程序常稱為傳代或傳代培養(yǎng)。

傳代方法：

（1）懸浮細(xì)胞：加生長液，然后分種

（2）貼壁生長細(xì)胞傳代：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

第六節(jié)動物細(xì)胞大量培養(yǎng)方法和操作方式

1、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法P103

（1）懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長增殖。優(yōu)點是操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)

和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，不但細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度一般較

低。

（目前在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌罐式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。）

2.貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上，細(xì)胞才能生長繁殖的培養(yǎng)方法。較容易采用灌流

培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度。但操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件

不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。

3.貼壁一懸浮培養(yǎng)

①微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長增殖，載體的體積很小，比重較輕，

在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。

②包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠

載體或微囊內(nèi)。包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；可以獲

得較高的細(xì)胞密度；可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。

（目前最普遍的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠）

③結(jié)團培養(yǎng)：結(jié)團培養(yǎng)的實質(zhì)是用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法進(jìn)行培養(yǎng)，

所以它也是一種貼附一懸浮培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法操作簡便，節(jié)省了微載體的成木。

2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式；P106

動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式一般可分為分批式、加料一分批或流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌流

式。

（1）分批式操作（-?種是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長，

產(chǎn)物不斷形成和積累。最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞?并

取出，培養(yǎng)結(jié)束。另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長至一定密度后，往反應(yīng)器

內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時間作用后，將反應(yīng)物取出。）

（2）半連續(xù)式操作

（該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一

段時間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補充同樣數(shù)

量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被

廣泛采用。）

（3）灌流式操作

（該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將

部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。它與連續(xù)式操作不同處，在于取出部分

條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出部分細(xì)胞。）

括號部分的內(nèi)容重在理解

第七節(jié)動物細(xì)胞生物反應(yīng)器

1,動物細(xì)胞生物反應(yīng)器必需具備的基本要求；P107

（1）一切材料，對細(xì)胞必須無毒性。（2）具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能。（3）密封性

能良好（4）對多種物理化學(xué)參數(shù)能自動檢測、調(diào)節(jié)和高精度控制（5）可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)（6）容

器內(nèi)面光滑，無死角（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修。設(shè)備成

本盡可能低。

2、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及特點；P108

（1）攪拌罐式生物反應(yīng)器（目前最廣泛應(yīng)用的動物細(xì)胞反應(yīng)器）：靠攪拌槳提供液相攪拌的動

力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性

（2）氣升式生物反應(yīng)器：其特點是結(jié)構(gòu)簡單，操作方便。

（3）固定床式生物反應(yīng)器：結(jié)構(gòu)簡單、裝填材料無毒且利于細(xì)胞貼壁，剪切力小的特點

（4）流化床式生物反應(yīng)器：可連續(xù)操作

（5）袋式或膜式生物反應(yīng)器：可取出某些有害代謝物

（6）中空纖維生物反應(yīng)器：用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，

細(xì)胞的密度高，如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉(zhuǎn)。

3、反應(yīng)器及檢測;P114

（1）溫度檢測元件：電阻溫度計；（2）PH：復(fù)合式參比電極

（3）溶氧：極普電極或電流式覆膜電極

第十節(jié)動物細(xì)胞制藥的前景與展望

1、動物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？P135

（1）改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量：①采用更強的啟動子和增強子②更好的利用擴增系

統(tǒng)或?qū)ふ腋弑磉_(dá)位點③采用和改造更好的宿主細(xì)胞

（2）利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本：①采用代謝工程改造工程細(xì)胞②改進(jìn)培養(yǎng)

工藝，降低生產(chǎn)成本

（3）抑制細(xì)胞凋亡，延長培養(yǎng)周期

（4）采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量

（5）轉(zhuǎn)基因動物的研究

（6）組織工程的研究

2、代謝工程：采用基因工程的手段，使工程細(xì)胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，

使其降低對某些營養(yǎng)物質(zhì)的需求，減少某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和無害，以及控制工程細(xì)胞的增殖速

度和制造產(chǎn)品的能力。P137

第四章抗體制藥

第一節(jié)概述P143

1、抗體：即Ig,指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

2、1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體(McAb)。

3、單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及

克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的特異性完全相同的高純度抗體。

單克隆抗體有缺陷：分子量過大；鼠源性抗體；所以要改造：降低單克隆抗體的免疫源性和

降低其相對分子量。P144

第二節(jié)單克隆抗體及其制備(重點)

1、克隆化：指單個細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團的整個培養(yǎng)過程。P148

2、什么是單克隆抗體？它是如何制備的？P144

(1)抗原與動物免疫

①制備高純度抗原：抗原可以用化學(xué)合成，如精制地高辛。多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩

選、克隆化。

②用抗原免疫脾細(xì)胞的制備：有體內(nèi)免疫法和體外免疫法。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹

腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，B細(xì)胞迅速增殖；體外免疫小鼠脾細(xì)胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，

再分離脾細(xì)胞。

(2)細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

①骨髓瘤細(xì)胞：和免疫動物同源，目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠(最常用)和LOU

大鼠。

②脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合：脾細(xì)胞(1X108)和骨髓瘤細(xì)胞(2X107)混合，在聚乙二醇誘導(dǎo)

下融合2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。(常用PEG相對分子量4000,濃度為40-50%,

二甲基亞網(wǎng)增加融合率)

③選擇性培養(yǎng):選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃喋吟(H)氨甲喋吟(A)胸腺嗑咤(T)配制。其上脾

—瘤融合細(xì)胞可以生長，脾一脾、、瘤一瘤融合細(xì)胞死亡。(培養(yǎng)基中需要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能繁

殖，常用飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等)

(3)篩選陽性克隆與克隆化

①篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。

②克隆化：有限稀釋法(將對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個細(xì)胞

接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。)和軟瓊脂法(將雜交瘤細(xì)胞稀釋到?定密度，

然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的)

(4)雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定

雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析。另外還檢測抗體特異性、純度、分子量等。

(5)單克隆抗體的大量制備

①體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法，多采用后者

②體內(nèi)誘生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接種雜交瘤細(xì)胞，取腹水，離心，取上清。

(6)單克隆抗體的純化

依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。

體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：

①離心取上清，超濾，鹽析。

②分離：凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化；陰離子交換層析IgG單抗純化；親和層析IgG單抗

純化。

3、ELISA法：酶聯(lián)免疫吸附試驗，基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙

烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成

分洗除。原理：酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也

不影響醐的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。

滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)

顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中

相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。P147

第三節(jié)基因工程抗體及其制備

（即鼠源性單克隆抗體的改造）

1、基因工程抗體：過PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)

系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體,被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床臨床診斷、預(yù)防、治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。P150

2、1g分子結(jié)構(gòu)P150

（1）由2條重鏈（簡稱H鏈）和2條輕鏈（簡

稱L鏈）組成"Y"字型結(jié)構(gòu)分子，鏈與鏈之間

由一對或一對以上的二硫鍵互相連接

（2）Ig分子氨基酸端L鏈的1/2與H鏈的

1/4的氨基酸組成及順序多變，構(gòu)成可變區(qū)（簡

稱V區(qū)），V區(qū)中某些特定位置構(gòu)建抗體和抗

原特異結(jié)合的關(guān)鍵部位，稱為互補決定區(qū)

（CDR）它賦于抗體以特異性。

（3）竣基端L鏈的1/2與H鏈的134的氨基

酸組成及順序較恒定，構(gòu)成恒定區(qū)（簡稱C區(qū)）,

它決定Ig分子的異種抗原性。

（4）L鏈有VL和J連個功能區(qū)，H鏈有Vir

CHI、CH2、四個功能區(qū)，VL和VH的CDR區(qū)共同構(gòu)成一個抗原結(jié)合部位。

3、基因工程抗體及其特性和制備方法（P152圖4-4）

（1）人鼠嵌合抗體：在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)（V區(qū)）基因分離出來，分別

與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤

細(xì)胞，就能表達(dá)完整人-鼠嵌合抗體。人IgC-小鼠IgV

（2）改形抗體（CDR移植抗體）：用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人

的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱浴Ｐ∈驝DR替代人CDR

（3）Fab抗體：重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗

原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3.（Fd：重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)）完整L鏈+重鏈V

區(qū)+CHI功能區(qū)

（4）Fv抗體：由VH和VL組成的具有完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段；VH+VL

（5）單鏈抗體：即scFv,由V”和VL通過連接肽（接頭）重組并表達(dá)而成的種小分子抗體,

其分子量為整個Ig分子的1/6具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特

性。VH-多肽-VL

（6）單域抗體：只有VH或VL一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。其分子量僅

為整個Ig分子的1/12。VH或VL

（7）最小識別單位：即MRU,只含有一個CDR多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。

第四節(jié)多功能抗體及其制備

1、雙功能抗體：bisFvs,即雙特異性單鏈抗體，（天然Ig是由兩個完全相同的VH和VL區(qū)域

構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識別并結(jié)合抗原的關(guān)鍵部位）經(jīng)人工設(shè)計構(gòu)建的雙特異性抗體由兩個不同

的抗原結(jié)合位點組成，可同時與兩種不同的抗原決定簌結(jié)合，并可將其偶連的藥物、酶或放射性

核素等導(dǎo)向到靶部位，這種具有雙價雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體。P155

2,多功能抗體：在scFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的scFv重組在一起，由此可制備成

多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。P157

3、抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為

抗體融合蛋白。P158

第五節(jié)抗體工程

1、抗體工程：指利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對

抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w

細(xì)胞后，表達(dá)抗體分子，或用細(xì)胞融合、化學(xué)修飾等方

法改造抗體分子的工程。P159

現(xiàn)在普遍使用噬菌體作為抗體庫技術(shù)的載體。

6.噬菌體抗體庫技術(shù)基本方法（過程）P159

噬菌體抗體庫技術(shù)：它是將體外克隆的抗體基因片段插

入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩

選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。

基本過程：噬菌體抗體庫技術(shù)基木路線為用RT-PCR方

法擴增抗體全套可變區(qū)基因（VH+VL）,重組到噬菌體

載體中，并通過與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，

把Fab段或ScFv表達(dá)到噬菌體表面。通過“吸附一洗脫

一擴增”的富集過程，從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基

因。（右圖）

第六節(jié)抗體診斷試劑

一、三大類抗體診斷藥物：血清學(xué)鑒定用抗體制劑、免

疫標(biāo)記技術(shù)用抗體制劑、體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物。P161

二、抗體診斷藥物有哪些類型？P161

1.血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑

（1）鑒定病原菌用的抗體試劑

（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑

（3）妊娠診斷試劑

（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清

2、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑P164

給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以

顯現(xiàn)，可對微量抗原進(jìn)行定性定量測定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組

織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測定。

（1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫鼠酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、

藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，

熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷和定位的目的。

（2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標(biāo)診斷試劑

a、HBsAg（乙型肝炎表面抗原）酶標(biāo)診斷試劑

b、HBeAg（乙型肝炎e抗原）酶標(biāo)診斷試劑

c、HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標(biāo)診斷試劑

d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)診斷試劑

e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診斷試劑

f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診斷試劑

（3）放射免疫用抗體診斷試劑

把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點結(jié)合起來建立的檢測技術(shù)。能測

出ng/ml,甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。

常用的標(biāo)記抗體試劑：

a、HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑：125I標(biāo)記，靈敏度0.1ng/ml

b,HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑:125I標(biāo)記,靈敏度0.1ng/ml

c、HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑：125I標(biāo)記

d、AFP放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑：125I標(biāo)記，靈敏度廣5ng/ml

e、CEA放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑：125I標(biāo)記，靈敏度1ng/ml

3、導(dǎo)向診斷藥物

由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導(dǎo)向藥物還未愛臨床廣泛應(yīng)用。

三、CD單克隆抗體系列P169

應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一種白細(xì)胞分化

抗原歸稱為CD(clusterofHfferentiation)。人CD的編號已從CD1命名至CD247,大致分為

13組。

第七節(jié)抗體治療藥物

1、抗體治療藥物有哪些？P173

以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。

(1)放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物

抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡便用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對腫瘤細(xì)胞殺傷

較大。

(2)抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物

①常用的抗癌藥物

氨甲喋吟(MTX)、阿霉素(ADM)、絲裂霉素(MMC)等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可

明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性體高二倍。

②抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性

(3)毒素偶聯(lián)的抗體藥物

在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。

①第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使其

僅在體外應(yīng)用。

②第二代免疫毒素是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的

結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。

③第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達(dá)。特異

性好、穩(wěn)定性強、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。

(3)免疫毒素的臨床應(yīng)用

治療腫瘤、自身免疫病，并能克復(fù)組織移植排斥反應(yīng)，可單獨給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其它

微粒中給藥。

第五章植物細(xì)胞制藥

第一節(jié)基本概念

1、植物細(xì)胞的全能性。P177

植物體中任何一個具有完整細(xì)胞核(完整染色體組)的細(xì)胞，在一定條件卜都可以重新再分化形

成原來的個體。

第二節(jié)植物細(xì)胞工程發(fā)展簡史(略)

第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特性

1、植物細(xì)胞是由細(xì)胞壁、原生質(zhì)體、后含物三大部分組成P181

2、細(xì)胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，動物細(xì)胞沒有

3,植物培養(yǎng)細(xì)胞重量的增加主要取決于對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的積累主要在穩(wěn)定期(植物細(xì)

胞培養(yǎng)時期：延遲期、加速期、對數(shù)期、穩(wěn)定期四個時期)

4、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性;P183

(1)生長階段特征

延遲期：細(xì)胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快

?加速期：最大生長期，最大細(xì)胞濃度

?對數(shù)期：細(xì)胞數(shù)呈對數(shù)增加

穩(wěn)定期：細(xì)胞高液泡化，非常脆弱

(2)植物細(xì)胞與動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞比較

特征哺乳動物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞

大小(pm)10^10010^100rio

生長懸浮、貼壁懸浮懸浮

營養(yǎng)要求很復(fù)雜較復(fù)雜很簡單

生長速度(倍增時間：慢；15~100慢；20'120快；0.5~5

h)

細(xì)胞分化有有限分化無

環(huán)境影響非常敏感敏感一般

細(xì)胞壁無有有

產(chǎn)物存在部位胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外

產(chǎn)物濃度低低高

含水量-約90約75

供氧需求1~2520~30100^1000

產(chǎn)物種類疫苗、單抗、酶、生長酶、天然色素、發(fā)酵食品、抗生素、

因子、激素、免疫調(diào)節(jié)天然有機化合物有機化合物、酶等

劑等

第四節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

1、植物材料的準(zhǔn)備；P185

植物組織培養(yǎng)的外植體必須是無雜菌材料。植物組織培養(yǎng)時表面處理的常用滅菌劑是次氯酸

鈣、次氯酸鈉、氯化汞。

2,植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成P186

(1)無機鹽：

①大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na

②微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等

(2)碳源：糖類，肌醇等；也可直接通過光合作用吸收C02

(3)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)P189

①生長素類：口引味乙酸(IAA)、

②分裂素：6-節(jié)基腺喋吟(6-BA)

植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的生長主要取決于生長素和分裂素的比例。高濃度生長素和低濃度分裂

素刺激細(xì)胞分裂，而低濃度生長素和高濃度分裂素刺激細(xì)胞生長。

(植物激素：指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度(〈1M)時即能調(diào)節(jié)植

物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。植物激素是目前已發(fā)現(xiàn)植物組織中

可以形成5種植物激素，即生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。)

(4)氮源：蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或各種氨基酸。

(5)維生素：B族維生素、生物素、肌醇。

3、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法及特點；P191

(1)大規(guī)模植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

①成批培養(yǎng)法(分批)：最適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器是氣升式反應(yīng)器

將培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器中，接種、培養(yǎng)?定時間后收獲細(xì)胞的操作方式

②半連續(xù)培養(yǎng)：在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)?段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行家換。

③連續(xù)培養(yǎng)：利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以?定速度連續(xù)采集細(xì)胞和

培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮配演技以使細(xì)胞生長環(huán)境維持穩(wěn)定。

(2)固定化培養(yǎng)

將細(xì)胞固定在固定化反應(yīng)器上(內(nèi))，放入新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)

行連續(xù)培養(yǎng)及收集產(chǎn)物，因?qū)⒓?xì)胞固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體及維持細(xì)胞間物理化學(xué)梯度，

易于細(xì)胞組織化，易于控制條件和獲得較高含量次級代謝產(chǎn)物。

第五節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物激積累的因素

1、影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素有哪些？P192

(1)生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等

(2)物理條件：溫度、光(強度、時間、光質(zhì))、通氣、PH和滲透壓

(3)化學(xué)條件：無機鹽、碳源、生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前

體等

(4)工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌、培養(yǎng)方法等

2、重要影響因素P193

(-)外植體選擇：不同外植體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累積時間各異。

(-)培養(yǎng)條件的影響

(1)內(nèi)在因素

①接種和誘導(dǎo)：次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外肢體的大小、細(xì)胞密度與營養(yǎng)成分相關(guān)

②培養(yǎng)基的基本組成：培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是穩(wěn)定

期的次級代謝產(chǎn)物的積累。(磷、氮；銅是次級代謝產(chǎn)物積累的必要元素)

③碳源：糖是使用最廣、作用最強的碳源，對次級代謝產(chǎn)物影響主要取決于使用的糖種類、糖

濃度及其次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程。

④植物生長調(diào)節(jié)劑：不同植物激素及其不同組合形式均可顯著影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

⑤@和PH：植物細(xì)胞正常呼吸需要氧氣，所以需要供氧；一般最利于培養(yǎng)植物細(xì)胞的PH在5~6

⑥滲出物：其它代謝產(chǎn)物也會影響產(chǎn)物產(chǎn)量

(2)外在因素

①溫度:代謝產(chǎn)物產(chǎn)生最佳溫度是20~28℃；②攪拌頻率：適宜③培養(yǎng)容器④光：光照時間、

光質(zhì)、強度都有影響

(三)兩步法培養(yǎng)：第一步使用適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)，第二步使用適合次級

代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基(生產(chǎn)培養(yǎng)基)。P197

第六節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器

1、植物細(xì)胞反應(yīng)器的選擇取決于：生產(chǎn)細(xì)胞的密度、通氣量、提供的營養(yǎng)成分的分散程度。P199

2、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器P201

(1)機械攪拌式生物反應(yīng)器：反應(yīng)器內(nèi)溫度、PH、溶氧及營養(yǎng)物物濃度易控制。

(2)鼓泡塔生物反應(yīng)器：沒有運動部件，操作不易染菌，有較高的熱量和質(zhì)量傳遞，容易放大，

但是流動形式難以確定，混合不均。

(3)氣升式生物反應(yīng)器：低剪切力，混合與氧傳遞效果好，運動部件不易染菌，操作費用低，

但是高密度培養(yǎng)時候混合不夠均勻。

(4)轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器：比較適合高密度培養(yǎng)，但是難于大規(guī)模操作，放大困難。

(5)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器：細(xì)胞可長時間重復(fù)使用，保護(hù)細(xì)胞免受剪切力，以實現(xiàn)高密度培

養(yǎng)，有利于次級代謝產(chǎn)物合成，易于連續(xù)化操作。

第七節(jié)進(jìn)展與展望

1、植物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些新進(jìn)展？P204

(1)誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞工程中的應(yīng)用：利用誘導(dǎo)子進(jìn)行有目的次級代謝產(chǎn)物調(diào)控及生物合成。

(誘導(dǎo)子：植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進(jìn)攻的某些次級代謝產(chǎn)物，觸發(fā)形成植

物抗毒素信號的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)子。誘導(dǎo)子有兩種分類，一種是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外形成而將其

分為內(nèi)源性誘導(dǎo)子和外源性誘導(dǎo)子；另一種是根據(jù)其來源分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。)

(2)前提飼喂

(3)兩相法培養(yǎng)：水相培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加入固相或疏水相，形成兩相培養(yǎng)系統(tǒng)，從而達(dá)到收集

分泌物的目的。

(4)轉(zhuǎn)基因技術(shù)

(5)植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥：生物轉(zhuǎn)化既可以生產(chǎn)新的化合物，又可以改造已有化合物、

增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

(生物轉(zhuǎn)化:利用離體培養(yǎng)細(xì)胞或器官及細(xì)胞器等對外源化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價值產(chǎn)物

的生理生化反應(yīng))

第六章酶工程制藥

第一節(jié)概述

1、酶工程：從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化

成有用物質(zhì)的技術(shù)。P216

2、酶工程主要研究內(nèi)容是什么？P216

(1)酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶的應(yīng)用開發(fā)。(2)酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研

究。(3)陋生產(chǎn)中基因工程的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究。(4)酶的分子改造與化學(xué)修飾、以及

酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究(5)有機相中酶反應(yīng)的研究。(6)酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)

和應(yīng)用研究。(7)抗體酶、核酸酹的研究。(8)模擬醐、合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成的

研究。

3、目前工業(yè)上應(yīng)用的酶大多采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)。P217

4、應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌：大腸桿菌、枯草桿菌、啤酒酵母、曲霉(黑曲霉和黃曲霉)。P218

5、酶法檢測可分為：單酶反應(yīng)、多酶偶聯(lián)反應(yīng)、酶標(biāo)免疫反應(yīng)。P218

第二節(jié)酶和細(xì)胞固定化

1、固定化酶的特點和優(yōu)點各是什么？P219

(1)固定化酶：限制或固定于特定空間位置的酶。

(2)固定化酶的特點：既具有生物催化劑的功能，又具有固相催化劑特性。

(3)優(yōu)點：①可多次使用；②反應(yīng)后，酶底物產(chǎn)物易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)

量高；③反應(yīng)條件易控制；④酶的利用效率高；⑤比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。

缺點：①酶活力有損失②成本增加③只適應(yīng)可溶性第五，且小分子底物④胞內(nèi)酶需分離純

化⑤與完整菌相比不適宜多酶反應(yīng)。

2、固定化細(xì)胞的特點和優(yōu)缺點各是什么？P225

(1)固定化細(xì)胞：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法。

(2)特點：有細(xì)胞特性，既有生物催化劑功能，又有固相催化劑特點。

(3)優(yōu)點：①無須進(jìn)行酶的分離純化②保持醐的原始狀態(tài)，酶回收率高；③比固定化醐穩(wěn)定性

高；④細(xì)胞內(nèi)酶附助因子可再生；⑤細(xì)胞本身含多酶體系；⑥抗污染能力強

缺點：①副產(chǎn)物多②細(xì)胞的壁、膜和載體都存在擴散限制作用③載體的空隙大小影響高分子底物

的通透性

3、酶和細(xì)胞的固定化方法P220

(1)載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法

①物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體(如活性炭等)上的固定化方法。

②離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不