1、標(biāo)題：BNC通過(guò)ERK1/2 信號(hào)通路保護(hù)H9c2 免受CardiomyoblastsH2O2-Induced氧化損傷摘要：Buchang naoxintong膠囊(BNC)是一種中藥批準(zhǔn)用于治療腦血管和心血管疾病。然而,人們很少知道特定的保護(hù)作用或BNC防止心肌損傷的機(jī)制。本研究旨在調(diào)查BNC在H2O2 誘導(dǎo)的H9c2鼠cardiomyoblasts的體外模型中的心血管效應(yīng)。在這項(xiàng)研究中使用的是BNC腸道吸收液，而不是含藥血清或提取液。我們的研究顯示，BNC預(yù)處理通過(guò)增加total-antioxygen、total-superoxide歧化酶、過(guò)氧化氫酶的活動(dòng)，和通過(guò)減少活性氧和丙二醛的生產(chǎn)

2、能增強(qiáng)抗氧化功能。BNC預(yù)處理也能激活細(xì)胞外signal-regulated激酶(ERK1/2)和抑制apoptosis-related蛋白質(zhì)如保利ADP-ribose聚合酶(PARP)和caspase-3。此外，加入BNC的預(yù)培養(yǎng)降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，改善線粒體膜電位，降低H9c2細(xì)胞的凋亡率。這些數(shù)據(jù)表明,BNC 通過(guò)增加抗氧化能力，激活ERK1/2，阻塞Ca2 + -dependent 和mitochondria-mediated凋亡而保護(hù)H9c2 cardiomyoblasts免受H2O2-induced氧化損傷?；谖覀兊难芯拷Y(jié)果，BNC保護(hù)H9c2細(xì)胞免受氧化損傷的效力與曲美他嗪相

3、似。1。介紹：氧化應(yīng)激在幾個(gè)主要的心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、心肌ischemical再灌注損傷起關(guān)鍵作用。明顯的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的活性氧(ROS),過(guò)度產(chǎn)生，,這是一個(gè)在心血管疾病的發(fā)展中重要的事件?；钚匝醴e累可能導(dǎo)致許多心血管疾病。細(xì)胞活性氧的來(lái)源主要是線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶、脂氧合酶/環(huán)氧酶、一氧化氮合酶以及各種物質(zhì)的自氧化尤其是兒茶酚胺類(lèi)。增加活性氧對(duì)心肌細(xì)胞造成重大損害，通過(guò)抗氧化分子如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)能拮抗這種損害。這些抗氧化劑分子能對(duì)抗氧化，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。此外，RO

4、S通過(guò)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用損害細(xì)胞膜。丙二醛(MDA)是一個(gè)主要的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)品，能反映出細(xì)胞損傷的程度。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞外signal-regulated激酶(ERKs)在一些細(xì)胞類(lèi)型的氧化應(yīng)激中被激活，在細(xì)胞功能的許多方面扮演了一個(gè)重要的角色。在心肌細(xì)胞中激活ROSERK1/2介導(dǎo)一系列活動(dòng)包括代謝、遷移、炎癥、細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡。事實(shí)上,DNA微陣列數(shù)據(jù)顯示,近100個(gè)基因參與細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)。事實(shí)上，DNA微陣列數(shù)據(jù)顯示,近100個(gè)基因參與細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)。Buchang naoxintong膠囊(BNC)由16個(gè)各種中藥組成包括黃芪、丹參、當(dāng)歸、赤芍、四川獨(dú)活草粉末、桃仁、紅

5、花,素乳香、沒(méi)藥、Spatholobus suberectus,牛膝根,桂枝,桑樹(shù)枝,蚯蚓,蝎子,水蛭。它是一個(gè)通過(guò)批準(zhǔn)用于治療中風(fēng)和心絞痛的中藥。BNC通過(guò)減少脂質(zhì)濃度和抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟避免小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。BNC也能增加CYP2C19酶的催化活性。BNC和氯吡格雷增強(qiáng)CYP2C192基因突變患者的抗血小板效應(yīng)。BNC已被證明對(duì)心臟和血管疾病有保護(hù)作用。然而，BNC心血管活動(dòng)的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未闡明。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)暴露H9c2細(xì)胞到過(guò)氧化氫中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。治療包括BNC腸道吸收液而不是提取溶液或含藥血清。曲美他嗪(TMZ)是一個(gè)常見(jiàn)的控制心臟病人,心絞痛的藥物。2、 材料和方法： （

6、1）成年男性的雄性sd大鼠中稱(chēng)重210g 左右。3 -(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2、5-diphenyltetrazolium溴化(肽),TMZ,過(guò)氧化氫溶液、The JC-1 商業(yè)設(shè)備、2,7二乙酸-dichlorofluorescein(DCFH-DA)探針,total-antioxygen容量(T-AOC)工具包,總超氧化物歧化酶(T-SOD)工具包,貓工具包,MDA工具包、 BNCs。 （2）、制備BNC腸道吸收液和治療大鼠腸道 將100克BNC粉溶解在2000毫升95%的乙醇，加熱溶液沸騰回流2小時(shí)(h)，然后過(guò)濾。在濾液中加水至200毫升，然后將BNC提取

7、液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)，直到幾乎完全干燥。加入Tyrode緩沖溶液（8.00克氯化鈉,氯化鉀8.00 g,NaHCO3 8.00 g,NaH2PO4 0.05 g,MgCl2 0.10克,0.20 g、葡萄糖1.00 g,pH值7.4）到BNC提取液中使溶液達(dá)到600毫升。老鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。麻醉后，,每個(gè)大鼠的小腸很快被刪除。把洗了Tyrode緩沖溶液(0C)腸子,切成四14厘米段，每一段被由內(nèi)而外在一端結(jié)扎成一個(gè)囊。裝滿Tyrode緩沖區(qū)的囊在馬格努斯的浴中孵化5分鐘達(dá)到平衡。緩沖區(qū)是然后用BNC溶液(25毫升)交換，溫度維持在37C，不斷注入O2 / CO2(95% / 5%)。2 h

8、后，包含吸收成分(2毫升)的Serosal-side溶液被排放到管道中。BNC腸道吸收液通過(guò)microfiltrate膜(0.22m),過(guò)濾，存儲(chǔ)在20C。最初的BNC腸道吸收液的濃度是1毫克/毫升(藥材)。 （3）、液相色譜法：BNC腸道吸收液通過(guò)一個(gè)帶有水域ACQUITY C18柱（2.1mm X150mm,1.7m)的超高液相色譜(UPLC)分析，流動(dòng)相由乙腈和梯度洗脫流速為0.3毫升/分鐘的0.5%甲酸組成。檢測(cè)波長(zhǎng)被設(shè)定在235、280、324和400nm，注射量是2L，溫度維持在30C。 （4）、細(xì)胞培養(yǎng)和治療：H9c2細(xì)胞系在中國(guó)的北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的細(xì)胞資源中心得到，細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充

9、有10%胎牛血清(杭州四季青,中國(guó)),的high-glucose DMEM(美國(guó)表達(dá)載體)中，37C濕潤(rùn)5%二氧化碳?xì)夥战Y(jié)合penicillin-streptomycin。近80%的細(xì)胞融合，然后用不同濃度的BNC處理24h,然后加入100M H2O2 1h。 （5)、利用MTT測(cè)定：過(guò)氧化氫的最佳濃度和應(yīng)用時(shí)間，BNC 對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用由MTT試驗(yàn)確定。被處理之前，細(xì)胞被胰蛋白酶化分散和播種在(8000 - 10000)細(xì)胞。隨后，把20L肽溶液(5毫克/毫升)添加到每個(gè)well,在37C,下孵化4 h。棄去上層清液，,不溶性甲瓚產(chǎn)品于溶解150L DMSO溶液。每個(gè)培養(yǎng)的well被

10、酶標(biāo)(分子器件、美國(guó))在波長(zhǎng)570 nm下測(cè)定。 （6）、H9c2細(xì)胞溶解產(chǎn)物的生化分析：胰蛋白酶化后H9c2細(xì)胞被調(diào)整1106cell/mL，用phosphate-buffered鹽水洗凈(PBS)兩次，并在1500轉(zhuǎn)/分鐘超速離心 10分鐘。棄去上清液，用超聲波粉碎離心沉淀。酶標(biāo)測(cè)定 T-AOC, T-SOD, CAT, 和 MDA。用BCA布拉德福德蛋白質(zhì)測(cè)定(皮爾斯,美國(guó))測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 （7）、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS：用DCFH-DA探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS 。用10M DCFH-DA孵化消化H9c2細(xì)胞懸濁液30分鐘，然后用PBS水洗洗三次去除殘留的探針。用熒光酶標(biāo)(美國(guó)分子設(shè)備)測(cè)定細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定在488 n