1、.,1,動(dòng) 物 乳 腺 生 物 反 應(yīng) 器,.,2,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù),加快家畜品種的改良速度，提高肉、奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白,為大量患者造福。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最誘人的前景是作為生物反應(yīng)器，利用它生產(chǎn)人類所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物，其常用方法是把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)、唾液腺或乳腺等器官或組織中表達(dá)，從而獲得人類需要的目的產(chǎn)物。,根據(jù)目的蛋白表達(dá)部位的不同可分為乳腺生物反應(yīng)器、血 液生物 反 應(yīng) 器 、卵 生 物 反 應(yīng) 器 、尿 生 物 反 應(yīng)器、精囊腺生物反應(yīng)器、唾液腺生物反應(yīng)器等。,.,3,乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟,乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展,乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題,乳腺生物

2、反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用,.,4,原理: 應(yīng)用重組 DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段的動(dòng)物胚胎中，經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。 外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)，即需要一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下，使其在乳腺中表達(dá)再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。,乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟,.,5,步驟,.,6,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素（ EPO ）,將EPO DNA分別以Hind和BamHI酶切，回收5.4kb的Hind/BamHI片段，插入pGEM-7zf

3、(+)載體，再將867bp的BLG啟動(dòng)子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠，其乳腺中的EPO含量可達(dá)0.5g/ml。,.,7,20世紀(jì)80年代末提出動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的設(shè)想 1987年，Gordon等首次報(bào)道在小鼠的乳腺中表達(dá)了人的組織纖溶酶原激活劑(tPA)基因。 1991年，WrightG等培育成乳腺特異表達(dá)人抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊，表達(dá)水平高達(dá)35g/L，在世界范圍內(nèi)引起了極大的轟動(dòng)。 1991年，Brem等報(bào)道乳腺表達(dá)牛凝乳酶的轉(zhuǎn)基因兔，表達(dá) 水平達(dá)到110g/L。 1992年，Ve-lande：等報(bào)

4、道了乳腺表達(dá)人C蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，表達(dá)水平達(dá)到1g/L以上。 目前，從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶和人C蛋白等基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并已初步形成以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺為主要生產(chǎn)手段的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。,乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展,國外研究進(jìn)展,.,8,20世紀(jì)80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu) 想 ，并成功獲得表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔 ，為 我國通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎(chǔ)。 1995年，我國首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因； 1996年10月上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)合作研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子的轉(zhuǎn)基因羊。 2005年，國家 “863”

5、計(jì)劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù) ，分別獲得了 轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)人溶菌酶、轉(zhuǎn)乳清白蛋白等轉(zhuǎn)人基因 蛋白，其中人乳 鐵蛋白和人-乳清白蛋白是國際上首次 利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得的。 雖然我國在該項(xiàng)技術(shù)上取得了較大進(jìn)展，但還處于探索階段，與國外還有一定的差距。 自國家“863”計(jì)劃對 “動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)用研究”立項(xiàng)后，逐步受到有關(guān)部門和企業(yè)界的重視，研究和開發(fā)的力度加 強(qiáng)，前景非常樂觀。,國內(nèi)研究進(jìn)展,.,9,表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性 利用DNA重組技術(shù)的微生物來生產(chǎn)的藥用蛋白,由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工, 因而生物活性低, 并且具有免疫原性。 產(chǎn)品成本低,可以大規(guī)模

6、生產(chǎn) 藥物其效率是利用以大腸桿菌和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的100倍 產(chǎn)品質(zhì)量高,易提純 生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣,極易提純。,乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用,.,10,應(yīng)用,組織纖溶酶原激活劑(TPA)：由美國遺傳技術(shù)公司開發(fā)的血栓溶解劑，1987 年11月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市。1988年的銷售額為1.51.6億美元，1989年為1.81.9億美元。今后每年的市場銷售額約為22.5億美元。 重組人抗凝血酶ii:世界上第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。重組人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。 2010年，轉(zhuǎn)

7、基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額達(dá)到350 億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類的90%以上。,.,11,目的基因在動(dòng)物基因中的整合問題,由于目的基因在動(dòng)物基因中的整合是隨機(jī)的，因此包括整合位點(diǎn)、整合的拷貝數(shù)等機(jī)制還不清楚。所以易發(fā)生調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定、表達(dá)率不高等問題。,乳腺生物反應(yīng)器的存在的問題,.,12,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成活率低,在目的基因的分離和改造，乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)上存在缺陷，無法保證對基因的定點(diǎn)整合，因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常會出現(xiàn)繁殖力下降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷 。,.,13,安全性,動(dòng)物體內(nèi)雖然可以對外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在自身機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)可對所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問題。 此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極大的威脅，所以在分