1、第八章 非線性色譜原理及其在蛋白質(zhì)分離與純化中的應(yīng)用,1、制備型液相色譜 preparative liquid chromatography,06:00:26,獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。 半制備柱（內(nèi)徑8mm，長(zhǎng)度15 30cm），一次制備量.1mg；,2.制備HPLC概述主要結(jié)構(gòu)單元,輸液部:輸液泵 shimadzu LC-6AD(適用于分析-半制備,再循環(huán)半制備) 分離部:制備柱 內(nèi)徑2050mm，柱長(zhǎng)50cm。 檢測(cè)部:檢測(cè)器 shimadzu SPD-M10Avp 餾分部:餾分收集器 shimadzu FRC-10A,色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 對(duì)分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量

2、； 對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大 進(jìn)樣量； 超載：進(jìn)樣量超過(guò)柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。,制備HPLC概述柱容量,制備HPLC概述制備HPLC與 分析HPL比較,3. 制備型液相色譜儀,06:00:26,制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制備柱：內(nèi)徑2050mm，柱長(zhǎng)50cm。,基本概念,Cs=KCm 線性色譜:流動(dòng)相中的樣品濃度(Cm)與固定相中的樣品濃度(Cs)呈線性關(guān)系. 非線性色譜:Cm與Cs不存在線性關(guān)系的色譜. 分析色譜大多屬于線性色譜;制備色譜大多屬于非線性

3、色譜,非線性色譜的特點(diǎn),樣品的保留值可變:非線性色譜的保留值隨樣品及其濃度的不同而變化; 峰形的不對(duì)稱(chēng)性:不是高斯正態(tài)分布; 色譜峰的峰高與濃度不是線性關(guān)系:峰高增加的速率隨濃度的增加而下降.,非線性色譜理論基礎(chǔ),研究對(duì)象：樣品在固定相和流動(dòng)相中的濃度處于非線性關(guān)系下，各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)色譜分離過(guò)程的影響，建立起柱參數(shù)、溶質(zhì)性質(zhì)及操作條件之間的定量關(guān)系。 首先要了解Cs與Cm之間的函數(shù)關(guān)系，也即要研究吸附等溫線及相應(yīng)的吸附模型,吸附等溫線：一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上進(jìn)行的吸附過(guò)程達(dá)到平衡時(shí)它們?cè)趦上嘀袧舛戎g的關(guān)系。,分類(lèi)：凸形、凹形、S形、H形、階梯形,圖8. 分布等溫線類(lèi)型及對(duì)色譜峰形和保

4、留時(shí)間的影響,通常出現(xiàn)于大多數(shù)小分子化合物,它反映了溶質(zhì)分子在固體表面達(dá)到飽和時(shí)生成了單分子吸附層，隨著溶質(zhì)濃度的增加，吸附等溫線的曲率逐漸減小，最后為零即達(dá)到飽和態(tài)。,“拖尾”,H型等溫線,是凸形等溫線的特殊狀態(tài)，它代表了一類(lèi)很容易在固體表面吸附的物質(zhì)，而且很容易達(dá)到飽和，這類(lèi)吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯,凹形吸附等溫線是適用于在低濃度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，從而生成多分子吸附層的那些物質(zhì)，所以這種吸附等溫線的曲率隨濃度的增加而增加。,S形等溫線實(shí)際上是凸形與凹形兩種等溫線疊加的產(chǎn)物，它代表了被吸附的分子之間具有很強(qiáng)的作用力，能進(jìn)一步吸附其他分子，而

5、溶質(zhì)分子與固相表面的作用力相對(duì)較弱，或者與表面覆蓋率無(wú)關(guān)。,？問(wèn)題：各種類(lèi)型等溫線代表的溶質(zhì)在兩相間具哪些分配特性？ ？問(wèn)題：從吸附等溫線能提供哪些非線性色譜性質(zhì)的信息？,吸附等溫線可以提供以下信息： 預(yù)測(cè)代表該吸附等溫線的組分在非線性色譜中色譜峰的形狀； 為非線性色譜分離與純化物質(zhì)選擇最佳條件； 反映被分離物質(zhì)分子與固定相表面的作用，從而研究分子的構(gòu)型及吸附狀態(tài)。 建立分子結(jié)構(gòu)-吸附之間的定量關(guān)系，從而由分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)吸附性能。,吸附等溫線的測(cè)定 A、靜態(tài)測(cè)量法 q與C之間的關(guān)系（q：溶質(zhì)在吸附劑上的濃度；C：溶液濃度）： q=C.V/G （V為溶液體積，G為吸附劑量） 優(yōu)點(diǎn)：方便簡(jiǎn)單，不需要

6、特殊的儀器 缺點(diǎn)：測(cè)量緩慢，平衡時(shí)間長(zhǎng)，平衡點(diǎn)不容易判斷，數(shù)據(jù)不易測(cè)準(zhǔn)，對(duì)比較昂貴的生物樣品不合適。,B、動(dòng)態(tài)法 常用的有4種方法: 前沿分析法(FA) 特征點(diǎn)前沿分析(FACP) 特征點(diǎn)洗脫(ECP) 平臺(tái)洗脫(EP),非線性色譜基本理論（P146147） 吸附平衡熱力學(xué)； 吸附平衡動(dòng)力學(xué); 色譜基本物料平衡方程。,色譜基本物料平衡方程可以解釋為何不同的吸附等溫線會(huì)產(chǎn)生不同形狀的非線性色譜峰,非線性色譜固定相,非線性色譜中粗和細(xì)的顆粒都在使用，原則上細(xì)顆粒填料的柱效高，價(jià)格比較貴。粗顆粒填料柱效低，但價(jià)格便宜，而且柱壓低適合制備柱。 從材料看目前有：硅膠類(lèi)和有機(jī)樹(shù)脂類(lèi)。 孔徑大?。簩?duì)不同生物

7、大分子分離有各自不同的合適孔徑大小,色譜柱及填充技術(shù),最長(zhǎng)柱長(zhǎng)！原因： 超過(guò)-無(wú)法得到均勻填充床； 柱效不是與柱長(zhǎng)永遠(yuǎn)成比例增長(zhǎng)； 高壓泵的容量的限制。,色譜柱及填充技術(shù),填充方式： 干法：適用于直徑30um的顆粒； 濕法：適用于直徑20um的顆粒。,在用溶劑平衡時(shí)，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細(xì)顆粒，否則由于細(xì)顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低。,為防止出現(xiàn)死空間而降低柱效，可對(duì)制備柱采用壓縮技術(shù),樣品溶解與進(jìn)樣技術(shù),增加溶質(zhì)的溶解度： 溶劑的性質(zhì)必須適應(yīng)于所用的固定相；,使大量的樣品溶液導(dǎo)入色譜柱后不馬上擴(kuò)散,在反相色譜中，溶解樣品的溶劑極性必須大,吸附色譜中恰恰相反，溶劑的極性必須小于

8、流動(dòng)相,疏水作用色譜中，溶劑的離子強(qiáng)度不能小于流動(dòng)相的離子強(qiáng)度,進(jìn)樣：必須保證大量樣品溶液能均勻分布在柱的截面上，使軸向擴(kuò)散及局部超載降至最低。,（1）采用帶樣品管的六通進(jìn)樣閥；（2）用高壓泵直接輸送樣品,非線性色譜的3種展開(kāi)方式,1.超載洗脫：與傳統(tǒng)的洗脫方法差別不大。但樣品在固定相上的負(fù)載超過(guò)了線性洗脫色譜的容量，展開(kāi)時(shí)濃度逐漸稀釋?zhuān)纬奢^寬而平坦的峰。 優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)率高，省時(shí)，節(jié)省溶劑 缺點(diǎn)：柱效不如線性洗脫高，溶劑不斷稀釋?zhuān)笃诩兓闊?非線性色譜的3種展開(kāi)方式,2.前沿分析：樣品溶液不是作為一部分進(jìn)入色譜柱，而是連續(xù)不斷地輸入色譜柱，即它本身起了流動(dòng)相的作用。洗脫展開(kāi)峰是以一個(gè)個(gè)臺(tái)階的方式展示的。,適合濃縮痕量組分; 適合產(chǎn)品精制,除去痕量組分