1、2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,1,第四章 體內(nèi)藥物分析 方法的建立與驗證,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,2,分析方法的設(shè)計依據(jù) 分析方法建立的一般步驟 分析方法驗證的內(nèi)容與要求 體內(nèi)藥物分析應(yīng)用示例,本章內(nèi)容提要,第四章 分析方法的建立與驗證,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,3,第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),建立分析檢測方法的主要依據(jù) 待測藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況 分析測定的目的與要求 生物樣品的類型與預(yù)處理方法 實驗室條件,第四章 分析方法的建立與驗證,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,4,一、待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況,準(zhǔn)確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物 預(yù)處

2、理待測物從結(jié)合物或綴合物中釋放 選擇樣品預(yù)處理方法首先應(yīng)考慮 待測藥物的理化性質(zhì) 藥物在生物體內(nèi)的存在狀況 藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化(代謝)途徑,第四章 分析方法的建立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,5,(一)待測藥物的理化性質(zhì),藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等預(yù)處理及檢測方法 具有親脂性在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取 具有強極性或親水性沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等 具有揮發(fā)性GC測定法 具有光譜或電化學(xué)特性分析檢測方法 藥物的穩(wěn)定性萃取濃縮技術(shù) 對酸堿不穩(wěn)定避免使用強酸或強堿性溶劑 對熱不穩(wěn)定避免高溫蒸發(fā)溶劑,第四章 分析方法的建

3、立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,6,(二)待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài),與血漿蛋白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低 分離萃取方法 蛋白結(jié)合較強不宜直接采用溶劑萃取 體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物 分析檢測技術(shù) 濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存） 代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定 采用LC-MS、EIA等分析檢測技術(shù),第四章 分析方法的建立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,7,二、分析測定的目的與要求,體內(nèi)藥物分析的目的影響分析方法的應(yīng)用 藥代動力學(xué)研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程 血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代

4、謝產(chǎn)物 要求同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物 檢測寬線性范圍(CmaxCmax的1/20)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬 性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離) 方法不必強調(diào)方法的簡便、快速； 大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS,第四章 分析方法的建立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,8,二、分析測定的目的與要求,臨床治療藥物監(jiān)測 有效治療濃度范圍內(nèi)藥物濃度 方法盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定 大多采用UV、RIA或EIA等 中毒患者的臨床搶救 藥物濃度極高 方法不必強調(diào)方法的靈敏度，強調(diào)方法的特異性和分析速度 大

5、多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC、GC-MS、RIA或EIA,第四章 分析方法的建立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,9,三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法,生物樣品的類型與預(yù)處理方法決定分析方法的應(yīng)用 以血漿或血清為分析樣品 采用蛋白沉淀-溶劑萃取預(yù)處理技術(shù) 分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測 用RIA分析 樣品的預(yù)處理方法可較為粗放 經(jīng)過簡單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測定,第四章 分析方法的建立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,10,四、實驗室條件,在設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法時，還應(yīng)充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室

6、使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。,第四章 分析方法的建立與驗證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù),2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,11,第二節(jié) 分析方法建立的一般步驟,一、分析方法的選擇 二、分析方法的建立 (一)檢測條件的篩選 (二) 分離條件的篩選,第四章 分析方法的建立與驗證,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,12,一、分析方法的選擇,體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計 生物樣品中的藥物濃度決定分析方法的首要因素 生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少 難以通過增加取樣量提高方法靈敏度 通過選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求 體內(nèi)藥物分析中常用分析方法特點見表4-1,第四章 分析方法的

7、建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,13,二、分析方法的建立,分析方法建立之前 查閱文獻(xiàn)資料充分了解藥物在體內(nèi)的動力學(xué)過程，使所擬定的分析方法 避免受到代謝產(chǎn)物的干擾適用于實際生物樣品測定,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,14,二、分析方法的建立,初步擬定分析方法后 進(jìn)行一系列試驗工作選擇最佳分析條件 同時驗證分析方法的可行性確認(rèn)是否適用于實際生物樣品 分析方法的建立和驗證過程是不可截然劃分的 為便于討論而分別敘述 分析方法的建立步驟 第一步：檢測條件的篩選 第二步：分離條件的篩選,第四章 分析方

8、法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,15,(一)檢測條件的篩選,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測定 確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度 HPLC 調(diào)整檢測器(類型、條件) 色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經(jīng)、柱長度) 流動相(組分及其配比)及其流速 柱溫、進(jìn)樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等 使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間(tR),第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,16,(二)分離條件的篩選,在進(jìn)行分離條件篩選

9、時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下： 1空白溶劑試驗 溶劑(方法特異性) 2空白生物基質(zhì)試驗 endogenous compounds(方法特異性) 3模擬生物樣品試驗 方法效能指標(biāo) 4實際生物樣品測試 代謝產(chǎn)物(方法特異性),第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,17,1空白溶劑試驗,待測藥物的非生物基質(zhì)溶液（通常為水溶液） 采用擬定的分析方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)、萃取分離等 樣品預(yù)處理（反應(yīng)試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等） 測定響應(yīng)信號（如HPLC峰面積或峰高） 考察目標(biāo) 方法的特異性 空白值應(yīng)盡可能小，并能

10、有效校正,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,18,色譜分析法,可通過改變反應(yīng)條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質(zhì)、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測器類型 空白試劑信號應(yīng)不干擾藥物的測定（如R1.5） 本步驟主要考察 需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過程，若預(yù)處理過程僅為生物樣品的提取分離，則可不進(jìn)行該步驟，直接進(jìn)行空白生物基質(zhì)試驗,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,19,2. 空白生物基質(zhì)試驗,空白生物基質(zhì) (blank biological mat

11、rix) 如空白血漿 照 “1. 空白溶劑試驗” 項下方法操作 考察目標(biāo) 生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾（方法特異性） 在待測藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等)的“信號窗”（信號附近的有限范圍）內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,20,3. 模擬生物樣品試驗,模擬生物樣品(質(zhì)量控制,QC樣品)空白生物基質(zhì)中加入待測藥物 照 “1. 空白溶劑試驗” 項下方法操作 考察目標(biāo) 方法的線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、靈敏度 藥物的萃取回收率等各項技術(shù)指標(biāo) 同時進(jìn)一步檢驗生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對測定

12、的干擾程度，即方法特異性,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,21,色譜分析法,進(jìn)一步考察待測藥物(或內(nèi)標(biāo)物)與內(nèi)源性物質(zhì)(或其它藥物)的分離情況 色譜峰的 tR、n 和 T 是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點等 內(nèi)源性物質(zhì)是否對待測藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,22,4. 實際生物樣品的測試,空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗確定的分析方法及其條件 不能完全確認(rèn)是否適合于實際生物樣品的測定 藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)

13、合(如血漿蛋白結(jié)合物) 或代謝生成數(shù)個代謝產(chǎn)物及其進(jìn)一步的結(jié)合物(或綴合物) 實際生物樣品確立分析方法后，尚需進(jìn)行實際生物樣品的測試 考察目標(biāo)代謝產(chǎn)物對藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況 進(jìn)一步驗證方法的可行性,第四章 分析方法的建立與驗證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,23,第三節(jié) 分析方法驗證的內(nèi)容與要求,用于實際生物樣品分析之前 驗證 (validation) 分析方法的可行性與可靠性 方法驗證時應(yīng)考慮影響分析方法 所有可變因素(采樣,樣品制備,色譜分離,檢測與數(shù)據(jù)評價等) 使用的技術(shù)指標(biāo) 效能指標(biāo) 使用的樣品 通常采用模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品,第四章 分

14、析方法的建立與驗證,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,24,驗證步驟,首先為分析方法的驗證 特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率 定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性 其次為生物基質(zhì)中待測藥物穩(wěn)定性的驗證 室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,25,驗證的效能指標(biāo)與基本要求,1特異性避免干擾 2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍 3準(zhǔn)確度與實際狀況相符 4精密度結(jié)果可重現(xiàn) 5定量限達(dá)到峰濃度的1/101/20 6穩(wěn)定性確保所有樣品準(zhǔn)確測定 7提取回收率確保準(zhǔn)確度,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與

15、要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,26,一、方法特異性(專屬性或選擇性),方法的特異性(specificity) 又稱專屬性或?qū)Ｒ恍裕ǔＥc選擇性(selectivity)互用 系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力 專屬性表示所檢測的信號(響應(yīng))系屬于待測藥物所特有的 選擇性系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力 特異性函蓋二者，以驗證所測定的物質(zhì)與待測藥物的同一性 考察一個分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點：,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,27,1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,比較待

16、測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號 對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品） 空白生物基質(zhì) 模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對照品） 如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的 R 確證內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,28,2. 代謝產(chǎn)物的干擾,比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號 與代謝產(chǎn)物(在實際樣品中 tR 隨時間延長而增加)的 R 如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 或改變色譜條件(色譜柱)再比較 確證其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾 結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測定 必要時通過HP

17、LC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性 對于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測定 可采用LC-LC-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測后，考察其干擾情況,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,29,3. 伍用藥物的干擾,TDM 時 還要考慮患者可能同時服用藥物(通常為數(shù)有限)的干擾 比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號 如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致 確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,30,4. 與參比方法的相關(guān)性,除

18、上述方法外，有時還可使用參比方法對照 參比方法一般選用特異性強、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好的色譜法 如在TDM中使用UV(或RIA)時, 可以HPLC(或GC)為參比 參比方法測定結(jié)果為橫坐標(biāo)(X); 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y) 用最小二乘法計算回歸方程 YabX (坐標(biāo)標(biāo)度相等) 相關(guān)系數(shù)(r)表示兩種方法測得結(jié)果的一致性 若 r 1，表示擬定方法為非線性，如 RIA 中抗血清滴度選擇不當(dāng),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,31,4. 與參比方法的相關(guān)性,YabX 截距(a) 表示擬定方法受到恒定干擾的程度內(nèi)源性物質(zhì)(UV) 斜率(b)

19、 表示擬定方法受到比例干擾的程度標(biāo)記抗原不純(RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較除顯示分析方法的特異性外 斜率b表示兩種方法測得結(jié)果的一致性 若參比方法準(zhǔn)確度良好 若截距a0, 則擬定方法的準(zhǔn)確度(回收率)為100b(%),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,32,二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍,標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve） calibration curve or working curve 生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性（比例的程度） 通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價 除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模

20、式 回歸分析法為最小二乘法（least squares） 或加權(quán)最小二乘法（weighted least squares） 線性范圍（linear rang）標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 模擬生物樣品的測定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,33,二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍(續(xù)),標(biāo)準(zhǔn)曲線用模擬生物樣品建立 線性范圍(不包括零點)應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品 應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備,第四章 分析方

21、法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,34,標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法,1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(非生物基質(zhì)溶液)的制備 溶劑水或甲醇（或其他適當(dāng)溶劑） 濃度標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品中藥物濃度的 50倍以上 加入量為生物樣品總體積的 2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異 濃度較低應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì) 否則,在實際樣品測定時應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,35,2. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍,至少含58個濃度點(不包括零點,即空白) 可覆蓋全部待測生物樣品中的藥

22、物濃度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常數(shù)約為 2) 若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為2.5 設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1 (個體差異) 實際制備時：500、250、100、50、20、10 ,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,36,3. 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備,空白生物基質(zhì)(如血漿)加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻 為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時造成的損失 先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 再加入空白生物基質(zhì) 渦旋混勻 ,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥

23、物分析,37,4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,以待測藥物的檢測響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量, y )對模擬血藥濃度 (自變量,x) 求得回歸方程( yabx )及其相關(guān)系數(shù)( ) 在一組由至少7個濃度(不包括零點)構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，至多可有2個濃度點數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如： 樣品處理有損失、色譜圖有問題，或 顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線該數(shù)據(jù)參與標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸后，計算QC樣品或返算該點濃度時顯著偏離其標(biāo)稱濃度(配制濃度) 其余應(yīng)有至少5個濃度點在標(biāo)準(zhǔn)曲線上,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,38,5.

24、 加權(quán)最小二乘法,最小二乘法每個濃度點絕對誤差(yiyi)賦予同等的重要性 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達(dá)102) 低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求 加權(quán)最小二乘法回歸計算時增加一個權(quán)重因子(w) 各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對離差平方和達(dá)到最小 式中，wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第i個濃度點的權(quán)重因子,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,39,1）回歸方程(y = a + b x)參數(shù)的計算,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,40,2）權(quán)重因子的選擇,加權(quán)賦予低濃度點以

25、更大的權(quán)重 在實際工作中的一般方法 當(dāng)wi=1/(yi)2時，則 而yi與xi成正比 所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取wi=1/C2) 當(dāng)高濃度點測量值的準(zhǔn)確度下降過大 低濃度點權(quán)重過大，降低低濃度點的權(quán)重，wi=k/xi,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,41,標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求,藥代動力學(xué)或生物利用度研究 標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個濃度(通常為58個濃度,不包括零點) 最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度(Cmax)；最低濃度應(yīng)低于Cmax的10%5%，并應(yīng)為方法的LOQ(非LOD) 回歸方程的截距應(yīng)接近于零 相關(guān)系數(shù)要求 0.9

26、9(色譜法)或0.98(生物學(xué)方法) 若非線性，可分為高低兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)間不少于5個濃度)，分別加權(quán)回歸如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,42,三、準(zhǔn)確度,方法準(zhǔn)確度(accuracy) 系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度 應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定 一般用相對回收率(relative recovery，RR) 或 相對誤差(relative error，RE)表示,第四章 分析方法的

27、建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,43,1. 測定法,取空白生物基質(zhì)（如血漿）數(shù)份，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法操作，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控(quality control，QC)樣品 高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3個濃度 每一濃度至少5個樣本 與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,44,2. 結(jié)果計算與限度要求,計算 測定值M (measured)平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求

28、 相對回收率應(yīng)在85%115% (LOQ附近80%120%) RE在15% (LOQ附近為20%),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,45,四、精密度,方法精密度(precision ) 系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度 表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility) 反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一 實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.52ml) 使用模擬生物樣品測定,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,46,1. 表示方法,方法精

29、密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD= RSD= = 包括批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD日內(nèi)(within-day) 和批間(between-run或inter-assay)RSD日間(between-day，day-to-day),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,47,2. 測定法分別測定法(),照準(zhǔn)確度項下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個

30、濃度的QC樣品，并分析測定 批內(nèi)RSD 每一濃度56個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算3個濃度及每1濃度的RSD 批間RSD 每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算3個濃度(每一濃度56個分析批數(shù)據(jù))的RSD,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,48,2. 測定法連續(xù)測定法(),若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進(jìn)行3個批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為56個樣本)方差分析法 批間RSD = 批內(nèi)RSD = =,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/

31、7/30,體內(nèi)藥物分析,49,3. 限度要求,在藥代動力學(xué)和生物利用度研究中 對g/ml級水平的RSD一般應(yīng)10% ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)15% 在LOQ附近RSD應(yīng)20%。,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,50,五、定量限,方法定量限(limit of quantitation，LOQ) 系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度 又稱為方法靈敏度(sensitivity) 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(最低濃度點LOQ) 要求應(yīng)能滿足測定35個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度

32、準(zhǔn)確度在80%120%(或RE在20%的范圍內(nèi)) RSD20%,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,51,六、穩(wěn)定性與質(zhì)量控制,穩(wěn)定性包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性 方法穩(wěn)定性方法的耐用性 樣品穩(wěn)定性生物樣品的存放條件和時間、凍-融循環(huán) 測定法QC樣品穿插于實際樣品測定全過程 模擬(或?qū)嶋H)生物樣品及其預(yù)處理后的待測溶液進(jìn)行考察 要求準(zhǔn)確度85%115%(RE在15%范圍內(nèi))，RSD15%,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,52,七、萃取回收率,生物樣品的預(yù)處理方法 重點考慮方法準(zhǔn)

33、確度(或相對回收率)，操作簡便、快速 萃取回收率(絕對回收率，absolute recovery)，70% 萃取回收率與相對回收率的意義不同 萃取回收率考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的程度損失 相對回收率采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計算生物樣品中藥物濃度,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,53,1. 測定法,取空白生物基質(zhì)(如血漿)，照準(zhǔn)確度項下方法，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次 另取等量的相同3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定 AT經(jīng)萃取后的

34、QC樣品的檢測信號或比值(內(nèi)標(biāo)法) AS未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測信號或比值(內(nèi)標(biāo)法),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,54,2. 限度要求,萃取回收率一般應(yīng)50% 高、中濃度的RSD應(yīng)15% 低濃度的RSD應(yīng)20%。,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,55,第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例,第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究 一、文獻(xiàn)調(diào)研 性質(zhì)在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，

35、在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。,第四章 分析方法的建立與驗證,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,56,藥動學(xué)參數(shù),吸收過程空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%70% Cmax 口服500mg后平均Cmax為2.42.6mg/L Tmax 12h T1/2 血中T1/2約為4h，腎功能減退時稍有延長至6h 蛋白結(jié)合率20%40% 代謝 口服給藥24h內(nèi)，40%50%原形、15%代謝物經(jīng)腎排出,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,57,體內(nèi)分析方法,RP-HPLC 色譜柱ODS色譜柱 流動相甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)

36、緩沖液(三乙胺調(diào)節(jié)pH2.33.5)，或離子對色譜: 溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨) 檢測紫外或熒光檢測 生物樣品預(yù)處理 蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣 溶劑萃取法二氯甲烷-異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑 蛋白沉淀-溶劑萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-異丙醇提取,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,58,二、分析方法設(shè)計,1分析方法 血漿蛋白結(jié)合率低(20%40%)、以原形從腎排泄 生物等效性研究測定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度-時間曲線。初步擬定：采用RP-HPLC法 2檢測方法 紫外靈敏度1ng，若取血漿0.5ml

37、，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l進(jìn)樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng/ml以上，當(dāng)Cmax在2g/ml以上(口服500mg)時基本可滿足生物等效性研究要求 熒光靈敏度0.1ng，能滿足本試驗要求,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,59,二、分析方法設(shè)計（續(xù)）,3樣品制備方法 初步擬定采用簡便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進(jìn)樣分析 預(yù)試含75%乙腈的提取液100l進(jìn)樣后，色譜峰理論板數(shù)、對稱性下降(前沿峰)，進(jìn)而導(dǎo)致檢測靈敏度降低(峰高降低) 經(jīng)進(jìn)一步試驗，確定為： 血漿0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-異丙醇(9

38、5:5)5ml萃取 60氮氣流吹干流動相200l溶解20l進(jìn)樣 靈敏度可達(dá)2ng/ml(血漿濃度)，符合要求(Cmax2g/ml),第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,60,三、實驗方案,1給藥方案 20名受試者隨機分為兩組，每組10人 第1次試驗第一組口服受試制劑(相當(dāng)于環(huán)丙沙星500mg)，第二組口服相同劑量的參比制劑 第2次試驗第1次服藥后第7天開始，兩組交換給藥,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,61,三、實驗方案（續(xù)）,2血樣的采集與處理 分別口服給藥前和給藥后0.2

39、5、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57個t1/2)小時 由肘正中靜脈取血 4 ml 立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中，靜置5分鐘后，離心15分鐘(3000rpm)，分離血漿 -20冰箱中保存待測,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,62,三、實驗方案（續(xù)）,3血樣分析法 色譜條件 高效液相色譜儀(包括LC-10ATvp泵，RF-530熒光檢測器)；色譜柱為Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m) 流動相為乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)

40、，流速1.0ml/min 檢測波長為ex=277nm，em=445nm 柱溫為40。,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,63,三、實驗方案（續(xù)）,3血樣分析法 血漿樣品的預(yù)處理 取血漿0.5ml，加內(nèi)標(biāo)溶液(10g/ml諾氟沙星甲醇溶液）50 l、乙腈1.0ml，渦旋混合30s，離心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-異丙醇(95:5)混合溶劑5ml，渦旋振蕩1min，離心5min，棄去上層水相，吸取下層有機相，60下氮氣流吹干，殘渣加流動相200l，渦旋溶解30s，離心5min，取上清液20l進(jìn)樣,第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求,2020/7/30,體內(nèi)藥物分析,64,四、分析方法驗證,1方法特異性 環(huán)