1、瘧原蟲檢測技術(shù)，江，重慶市疾控中心課件負(fù)責(zé)人，2010年9月，瘧原蟲血涂片檢測是診斷和鑒定瘧原蟲種類的主要方法，也是瘧疾流行病學(xué)調(diào)查的重要組成部分。血涂片制作和染色質(zhì)量影響檢驗(yàn)結(jié)果，必須把握“三個(gè)層次”。載玻片清洗。干凈的載玻片沒有油脂、劃痕和灰塵，載玻片上有油跡，這使得厚的血膜容易脫落，薄的血膜涂布不均勻。用手指握住載玻片時(shí)，只能握住載玻片兩側(cè)的邊緣，不要觸摸載玻片表面，以免手指上的油污染載玻片。1.清潔載玻片。首先用熱肥皂水清洗新載玻片，然后用清水沖洗，然后用柔軟干凈的毛巾擦干，以備后用。(1)清洗新載玻片，用5%的肥皂水煮沸：將清洗肥皂切成小塊，加水制成約5%的肥皂水，煮沸后將載玻片一張

2、一張地放入肥皂水中，用小火煮約一刻鐘，然后熄滅火，直到肥皂水有點(diǎn)涼，然后擦去干凈的毛巾以備后用。(2)用過的載玻片有兩種清洗方法：浸泡在清洗液中：清洗液配制如下：重鉻酸鉀80g濃硫酸100ml水(純凈水)1000ml。制備時(shí)，先將重鉻酸鉀研磨到水中，緩慢加熱至完全溶解，然后緩慢加入濃硫酸，冷卻后將溶液倒入帶蓋的大玻璃瓶中。清洗載玻片時(shí)，將待清洗的載玻片一張一張地浸泡在清洗液中一兩天，然后取出清水沖洗至完全變黃。浸泡前，最好用二甲苯去除鏡面油。清洗液顏色變成深綠色后，將失去清洗效果，不能重復(fù)使用。1.血液薄膜涂層2。厚血膜涂層厚血膜標(biāo)記、1。薄血膜涂層。薄血膜涂層(1)首先用75%酒精棉球?qū)Χ?/p>

3、進(jìn)行消毒，當(dāng)酒精變干時(shí)，用采血針快速刺入耳垂下端邊緣附近。(2)用左手拇指和食指擠壓耳垂，右手中指向相反方向擠壓。(3)取一個(gè)干凈的載玻片，使其左側(cè)1/3的表面接觸耳垂上的血滴(不要使載玻片接觸耳垂上的皮膚)，這樣載玻片上就有一小滴血。健康卷1-1.5毫米3 .1/4匹配頭部尺寸。(4)在血液溶解之前，將推動(dòng)器與血液接觸。血液沿推片邊緣擴(kuò)散后，保持推片與載玻片成30角，從右向左均勻推出推片，形成一層薄薄的血膜。涂好的薄血膜只有一層血細(xì)胞，血細(xì)胞的分布和排列相對均勻，血膜的末端突出如舌。如果取的血滴太大，涂膜太寬太厚；如果推力不均勻，很容易形成梯田。如果推力太大，血液膜兩端太厚，如果涂片上有油污

4、，血液膜就會變得多孔。涂上薄薄的血膜后，輕輕擠壓耳垂，擠出一個(gè)火柴頭大小的血滴，將這個(gè)血滴滴在載玻片的中心1/3處，然后用推動(dòng)片的一角旋轉(zhuǎn)，將其涂成直徑約一厘米的圓形血膜。旋轉(zhuǎn)涂布時(shí)間不應(yīng)太短，以免形成纖維蛋白束和覆蓋瘧原蟲。在濃血薄涂好之后，應(yīng)該把它放平并晾干，以防止蒼蠅舔血膜或灰塵落在上面。受試者的號碼可以用鉛筆或鋼筆寫在薄血膜的邊緣，或者用蠟筆寫在厚血膜的一端。2。厚血膜包衣、血膜生產(chǎn)和染色質(zhì)量規(guī)范、血膜生產(chǎn)和染色質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)1。血片制作質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)：好：所有的厚血片和薄血片都好，或者薄血片都好，但是在厚血片中。中：薄血膜為中，厚血膜為好或中。差：差的薄血膜或差的厚血膜。2.對血液切片制

5、作和染色合格率的要求：合格率是結(jié)合血液切片制作、染色和清洗的清潔度好、中、差來計(jì)算的。有兩種常用的染色方法：姬姆薩法和瑞奇法。(1)姬姆薩染色法：姬姆薩染色法是最可靠的血膜染色法，其優(yōu)點(diǎn)是易于掌握，染色后的血膜褪色緩慢。吉姆薩染色劑粉末0.5g甘油(中性)25ml甲醇(純，分析純)25ml將吉姆薩染色劑粉末0.5放入研缽中。將完全研磨的Giemsa甘油溶液倒入無水的、干凈的棕色玻璃塞瓶中，然后在研缽中加入甲醇以洗去染料并將其倒入瓶中，直到研缽用25%甲醇洗滌并倒入瓶中，緊密塞住，徹底搖動(dòng)，在室內(nèi)放置一周，每天搖動(dòng)幾次，然后使用。1。姬姆薩染料的制備：為了保證良好的染色效果，瘧原蟲的紅核和藍(lán)胞質(zhì)

6、是清晰的，而薛對感染的紅細(xì)胞，新鮮的蒸餾水可能接近中性，但儲存一段時(shí)間后，它會變成酸性，因?yàn)樗湛諝庵械亩趸?，所以必須在蒸餾水中加入緩沖溶液，使其達(dá)到我們需要的酸堿度。2.緩沖溶液的制備；磷酸氫二鈉(無水)9.5g蒸餾水1000ml磷酸二氫鉀9.07g蒸餾水1000ml。將上述兩種液體分別儲存在密封的玻璃瓶中。緩沖液的配制：稀釋染料的蒸餾水的最佳ph值為7.0-7.2，可按下表配制：緩沖蒸餾水的配制(毫升)，ph值為磷酸二氫鈉溶液和磷酸二氫鉀溶液的蒸餾水，不管是否有。39795.79777777753染色步驟：固定：在用姬姆薩染料溶液染色前，必須用甲醇或無水乙醇固定薄血膜。將其滴在薄血膜

7、上，或用玻璃棒將甲醇蘸在薄血膜上，以避免甲醇流到厚血膜上而誤固定。用蠟筆畫一條線，或者將載玻片傾斜放置，在載玻片上的甲醇蒸發(fā)后進(jìn)行染色。溶解血紅蛋白，向厚厚的血膜中加入2-3滴蒸餾水，待血紅蛋白完全溶解后，將水倒在載玻片上，待血膜干燥后進(jìn)行染色。染色：快速染色：5: 1 (20%)，5滴水，1滴染料溶液(原液)，染色5分鐘，用清水沖洗。慢速染色：20: 1 (5%)，20滴水，1滴染料溶液(原液)，染色30分鐘，用清水沖洗。用水干燥藥片后進(jìn)行顯微鏡檢查。(2)賴特染色法：賴特染色法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單快捷，但缺點(diǎn)是染液在熱環(huán)境中易變質(zhì)，染色時(shí)間不易掌握，血膜上有染料沉淀；用這種方法染色的血膜褪色快

8、，不適合長期保存。萊特染料粉末0.2克甘油(中性)3毫升(中性)甲醇(中性)97毫升將萊特染料粉末放入研缽中，加入甘油并徹底研磨，然后加入10毫升甲醇，混合并倒入干燥干凈的棕色玻璃瓶中，然后分階段將甲醇倒入研缽中，直到研缽中的染料被清洗干凈，通過徹底搖動(dòng)即可使用制備好的染料溶液。1.賴特氏染色法的準(zhǔn)備：(1)用蠟筆在厚的和薄的血膜之間畫一條線，然后用緩沖液在干燥的厚血膜上蒸2-3滴水，溶血后倒出這些水滴。(2)向薄血膜中加入5-8滴萊特染料溶液并染色1-2分鐘。(3)向薄血膜中加入5-8滴緩沖蒸餾水，用吸管混合均勻，然后向厚血膜中加入染料溶液，使厚血膜可以同時(shí)染色約10分鐘。(4)用清水輕輕沖

9、洗染液，將載玻片直立，在顯微鏡下觀察，(2)染色步驟，(4)顯微鏡檢查，(1)間日瘧原蟲薄血片中寄生紅細(xì)胞的形態(tài)變化大?。好黠@腫脹顏色：褪色斑點(diǎn)：紅色薛氏點(diǎn)，數(shù)量多，反復(fù)感染：罕見，小滋養(yǎng)體，細(xì)胞質(zhì)：淡藍(lán)色，大等。細(xì)胞核：紅色，通常為圓形。體積：相對較大，約占紅細(xì)胞直徑的三分之一。，大滋養(yǎng)體，細(xì)胞質(zhì)：阿米巴樣，含幾個(gè)液泡，體積大，淡藍(lán)色核：一個(gè)，點(diǎn)狀或桿狀，瘧疾色素：短桿狀，小，褐黃色，細(xì)胞質(zhì)：阿米巴樣，體積大，小或消失的液泡，藍(lán)色核：2-10個(gè)腫塊，不規(guī)則，瘧疾色素：細(xì)桿狀形狀：圓形，較小的細(xì)胞質(zhì)：淡藍(lán)色，核：松散，較大，通常位于中央。瘧疾色素：棕色，棒狀，均勻分散，小配子體，大配子體，圓形

10、，較大的細(xì)胞質(zhì)：深藍(lán)色核：致密，位于一側(cè)。瘧疾色素：棕黃色，均勻分散，數(shù)量眾多。(2)間日瘧原蟲有厚的血片和小的滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)：大多數(shù)呈“驚嘆號”、“問號”和飛鳥的形狀。核心：大的，主要是一個(gè)。間日瘧原蟲的大滋養(yǎng)體相當(dāng)大，形狀各異，變化很多。細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，分散并破碎成大小不等、邊緣不清的圓形塊狀，這是間日瘧原蟲大量營養(yǎng)的特征。細(xì)胞核是一個(gè)大而明顯的不規(guī)則圓，位于細(xì)胞質(zhì)的中心或邊緣。瘧疾色素呈短桿狀，棕黃色，分布于細(xì)胞質(zhì)中。大型滋養(yǎng)體，胞質(zhì)多，形態(tài)變化大，分布破碎成塊狀，細(xì)胞核分裂成幾個(gè)大的圓形或不規(guī)則圓形，分散在胞質(zhì)中。有許多棕黃色的短桿瘧疾色素。裂殖子前期細(xì)胞質(zhì)多，形態(tài)變化大，有分布性斷裂和阻

11、滯現(xiàn)象，細(xì)胞核分裂成若干大塊，呈圓形或不規(guī)則圓形，分散在細(xì)胞質(zhì)中，并有許多棕黃色短桿狀瘧疾色素。裂殖子前期有12-24個(gè)裂殖子，色素集中，位于中央或一側(cè)。成熟裂殖子和間日瘧原蟲的配子體非常大，幾乎與中性粒細(xì)胞一樣大，細(xì)胞質(zhì)為圓形或橢圓形。雌雄配子體的形態(tài)與薄片上的完全相同，有時(shí)配子體與晚期滋養(yǎng)體相混淆，但配子體的細(xì)胞質(zhì)相對堅(jiān)實(shí)，色素顆粒眾多，沿邊緣分散分布。配子體、間日瘧配子體和間日瘧配體配子體，1個(gè)惡性瘧原蟲薄血膜環(huán)，該環(huán)細(xì)長，一個(gè)細(xì)胞核約為紅細(xì)胞直徑的1/5，但2個(gè)普通紅細(xì)胞往往含有2個(gè)以上的原生動(dòng)物，往往位于紅細(xì)胞邊緣，表現(xiàn)為“鳥飛”，2個(gè)惡性瘧原蟲大滋養(yǎng)體，一般不出現(xiàn)在外周血體中帶有小

12、、強(qiáng)、圓且無活性的瘧疾色素此時(shí)， 暗褐色原生動(dòng)物開始集中在內(nèi)臟毛細(xì)血管、惡性瘧原蟲的3個(gè)早期裂殖子、惡性瘧原蟲的4個(gè)成熟裂殖子和836個(gè)裂殖子中，通常為1824個(gè)。 不規(guī)則排列的瘧疾色素集中成一個(gè)球，占惡性瘧原蟲雌配子體的23 34.5%，呈新月形，兩端致密，與通常位于中心的尖核相比呈深紅色，暗褐色的瘧疾色素分布在核心周圍，惡性瘧原蟲的5個(gè)雄配子體呈香腸形，兩端鈍，細(xì)胞質(zhì)為藍(lán)色，略呈紅色，細(xì)胞核松散，呈淡紅色。位于中央的瘧疾色素呈黃褐色，小桿狀，細(xì)胞核周圍有許多。惡性瘧疾的厚血片中有1-2個(gè)環(huán)狀細(xì)胞核，常顯示“！”還有鳥等等。巨藻通常是圓形的，瘧疾色素整合成1-2個(gè)簇。裂殖子很小，有8-26個(gè)裂殖子。配子體呈新月形，雄配子體呈香腸形。1.生物物質(zhì)血液中的性成分、白細(xì)胞碎片、血小板碎片、紅血細(xì)胞中的霍奇喬點(diǎn)、卡波西環(huán)、水生阿米巴原蟲、細(xì)菌、滴蟲等。特點(diǎn)：無瘧疾色素的拼布往往不完美，其大小與瘧疾色素不一致。染料、雜質(zhì)和灰塵。特點(diǎn)：沒有生物的自由死亡感，頻繁的折射和化妝痕跡。2。無生命物質(zhì)。血膜厚度和厚度差，血膜?。河醚伲?/p>