1、第六章 酶蛋白的化學(xué)修飾,1、概念 凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使蛋白質(zhì)（酶）共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變蛋白質(zhì)（酶）的某些特性和功能的過程都可稱蛋白質(zhì)（酶）的化學(xué)修飾。,一、酶的化學(xué)修飾,2、酶的化學(xué)修飾的目的和意義 目的： 構(gòu)象優(yōu)化、結(jié)構(gòu)穩(wěn)固 1 穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。 2 作用的最適條件不符。 3 酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。 4 臨床應(yīng)用的特殊要求。 意義： A.天然酶的活性維持存在缺陷；（如：異體蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制劑抑制、活性半衰期短）,B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如：酶蛋白抗酸、堿、有機(jī)溶劑變性及抗熱失活能力差，容易受產(chǎn)物抑制） C.天然酶的應(yīng)用存在

2、潛力。（如：通過酶的分子改造可提高酶的穩(wěn)定性、解除酶的抗原性、改變酶學(xué)性質(zhì)(最適pH、最適溫度、Km值、催化活性和專一性等)、擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍）,（1）分子生物學(xué)水平，即用基因工程方法對DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的酶蛋白（蛋白質(zhì)工程）。 （2）對天然酶分子進(jìn)行改造，這包括一級結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等（選擇性化學(xué)修飾）。,3、酶修飾途徑,1 如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 2 如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 3 如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 4 如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境,三 酶化學(xué)修飾的基本原理,（1）酶分子的表面修飾： 1）化

3、學(xué)固定：酶與惰性載體共價(jià)固定（即共價(jià)固定化酶）；,四、酶蛋白修飾的方法,2）小分子修飾：用化學(xué)小分子修飾酶的表面基團(tuán)；（如：對酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)，尤其酶活性中心的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾）,3）大分子修飾 非共價(jià)修飾:與大分子物質(zhì)非共價(jià)結(jié)合，增加酶的穩(wěn)定性; 共價(jià)修飾:用可溶性大分子共價(jià)連接于酶分子表面，形成覆蓋層.,4）分子內(nèi)交聯(lián)：增加酶分子表面基團(tuán)相互交聯(lián)，穩(wěn)定酶分子；,5）分子間交聯(lián)：用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)起來產(chǎn)生雜化酶,6）脂質(zhì)體包埋：固定化修飾之一，可改善穩(wěn)定性和免疫性；,7）反相膠團(tuán)微囊化：在非極性有機(jī)溶劑中加表面活性劑與酶形成含水分子的反相膠團(tuán)，酶分配在團(tuán)內(nèi)的水性環(huán)境中，使

4、酶與有機(jī)相分開，避免酶變性。,1）非催化活性基團(tuán)的修飾：如金屬離子置換修飾，可改變酶動力學(xué)性質(zhì)和酶親和能力； 2）酶蛋白主鏈修飾：有限水解修飾； 3）催化活性基團(tuán)修飾：選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代，即化學(xué)突變法； 4）肽鏈伸展后的修飾：為了有效處理酶分子內(nèi)部區(qū)域，先用脲、鹽酸胍處理酶，使酶鏈充分伸展，修飾后再折疊成具有某種活性的構(gòu)象；,（2）酶分子內(nèi)部修飾,酶蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的可反應(yīng)性； 修飾劑的可反應(yīng)性。,SH-CH2-CH2OH,二、化學(xué)修飾的機(jī)理,1、基團(tuán)定位因素 蛋白質(zhì)多數(shù)非極性側(cè)鏈(疏水側(cè)鏈)位于非常致密的分子基體的中心，而多數(shù)極性帶電側(cè)鏈(親水側(cè)鏈)位于基體的表面。蛋白質(zhì)分子

5、的表面特點(diǎn)影響化學(xué)試劑的接近。,(一)影響酶蛋白功能基團(tuán)反應(yīng)性的因素,2、蛋白質(zhì)局部微區(qū)性質(zhì)的影響 功能基的反應(yīng)性是通過它的親核性來顯示的，而親核性又常常與它的酸堿性有關(guān)，即與基團(tuán)的pK有影響。,微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。 如：乙酸在水中的pK為476，在80乙醇中增至687，在100乙醇中增至1032。乙酸羧基所處微區(qū)的極性直接與介質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。隨介質(zhì)極性降低，羧基的pK升高。,（1）微區(qū)的極性,卵清溶菌酶中第35號谷氨酸的-C00H在25時(shí)的pK為5.9，而當(dāng)溶菌酶與其抑制劑三-N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合后，此pK則升至6.4。 pK的提高可能是由于這個(gè)殘基的微區(qū)極性降低

6、之故。,35,提示：局部極性的改變對色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的影響最??；對氨基和組氨酸反應(yīng)性的影響較大；對酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應(yīng)性影響最大。,天然蛋白質(zhì)通過氫鍵來維持其穩(wěn)定性，也是使pK發(fā)生改變的一個(gè)因素。 例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。這是由于氟與酚基形成氫鍵的能力比溴強(qiáng)。 水楊酸的羧基可與其酚基形成O-HO氫鍵，結(jié)果使其羧基的pK比正常值小1，同時(shí)使酚基的正常pKl0改變到pKl3。,（2）氫鍵效應(yīng),不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK是不同的。 碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個(gè)組氨酸殘基。碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄球菌核酸酶的pK

7、是：5.37；5.71；5.74；650。組氨酸殘基在這兩個(gè)蛋白質(zhì)中的pK范圍是537723，pH幾乎相差2。這些變化可能是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。,（3）靜電效應(yīng),處于蛋白質(zhì)表面的功能基比較容易與修飾劑反應(yīng)。如果烷基在空間上緊靠功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，這時(shí)就要出現(xiàn)位阻效應(yīng)。 如：對枯草桿菌蛋白酶BKN的所有的10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且其結(jié)構(gòu)上的苯酚的羥基幾乎在所有情況下都沒有形成氫鍵。但是，如果對它進(jìn)行徹底硝化和碘化后，10個(gè)酪氨酸中只有8個(gè)被修飾。,（4）位阻效應(yīng),超反應(yīng)性指的是蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速反應(yīng)的能力。 蛋白質(zhì)中的功能基與簡單氨基

8、酸中的相同基團(tuán)相比，反應(yīng)性要差。 但是,每個(gè)蛋白質(zhì)分子中至少有一個(gè)基團(tuán)對一定的試劑顯示出超反應(yīng)性。超反應(yīng)基團(tuán)不一定是酶活性部位上的基團(tuán)。,（二）酶蛋白功能基團(tuán)的超反應(yīng)性,改變蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的pK值； 蛋白質(zhì)功能基團(tuán)具有較大的親核性； 通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當(dāng)取向； 試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學(xué)適應(yīng)性； 超反應(yīng)性由一個(gè)或幾個(gè)因素的綜合作用而產(chǎn)生。,影響超反應(yīng)性的因素：,蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面特性對接近氨基酸側(cè)鏈功能基的修飾劑也產(chǎn)生有利或不利的影響。因而對修飾劑也提出了一定的要求。,（三）修飾劑反應(yīng)性的決定因素,化學(xué)修飾前，修飾劑是根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在蛋白質(zhì)低或

9、高極性區(qū)的。 如：D-氨基酸氧化酶的巰基宜與N-烷基馬來酰亞胺的反應(yīng)，因?yàn)閹€基的辛基化速度比乙基化速度高15倍。說明巰基處在非極性環(huán)境中。修飾劑先與蛋白質(zhì)的巰基疏水鍵合，然后烷基化。 二硝基氟苯修飾牛血清白蛋白時(shí)，二硝基氟苯先與其疏水鍵合。,1、選擇吸附性；,2、靜電相互作用： 帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。 靜電相互作用可使修飾劑向多功能部位中的一個(gè)殘基定位，或向雙功能基的一側(cè)定位。,3、位阻因素； 蛋白質(zhì)表面的位阻因素或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。,4、催化因素； 修飾部位附近的其他功能基，如果起一般的酸堿催化作用，

10、也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異。 如對硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對胰凝乳蛋白酶的絲氨酸乙?；瘷C(jī)理相同，但后者反應(yīng)性差。,5、局部環(huán)境的極性： 許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無關(guān)。情況比較復(fù)雜。,1、了解酶的性質(zhì) 對酶的活性部位、酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件及酶的側(cè)鏈基團(tuán)等到的了解。,三、設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的要點(diǎn),2、選擇修飾劑的類型 修飾劑的分子量、鏈的長度、對蛋白質(zhì)的吸附性；修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)量和位置；修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。 一般要求修飾劑具有較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、修飾劑分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半

11、衰期較長。,3、選擇修飾反應(yīng)的條件 盡量少破壞酶活性功能的必需基團(tuán)。反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例；反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度和pH條件；反應(yīng)溫度及時(shí)間。,四、常用的化學(xué)修飾劑,糖及糖的衍生物： 主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝膠、聚乳糖等。 高分子多聚物： 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG) 聚乙烯(polyvinyl alcohol，PVA) 聚N-乙烯吡咯烷酮(poly（N-vinylpyrrolidone，PVP) 聚順丁烯二酸酐、聚丙烯酸(polyacrylicacid，PAA) 。,生物大分子： 常用的有肝素、血漿蛋白質(zhì)、聚氨基酸類等。 雙功能

12、試劑： 主要有戊二醛、二異硫氰酸、二胺類等。 其他 ： 常用的修飾劑還有某些固定化酶載體、糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑及某些小分子有機(jī)物等。,酶的化學(xué)修飾基本原則： 充分利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)過一定的活化過程與酶分子中的某些基團(tuán)或輔因子產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。,五、化學(xué)修飾的措施,酶分子中的可解離基團(tuán)如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等，都是可以被修飾的基團(tuán)。,1、修飾酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán),（1）對巰基的修飾： 烷化劑：如碘乙酸、碘乙酰胺、巰基乙醇、谷胱甘肽等。,E-SH+ICH2COOH（或ICH2CONH2） E-S-CH2COOH（或E-S-CH2CON

13、H2）+HI,（2）對氨基的修飾 乙酸酐修飾：,E-NH2+CH3COOCOCH3 E-NHCOCH3 + CH3COOH,修飾酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)舉例,（3）羧基的化學(xué)修飾 O NR 羰二亞胺反應(yīng)： E-COO-+R-N=C=NHR E-C O-C-NR （4）咪唑基的修飾反應(yīng) 碘代反應(yīng)： E-咪唑基+ICH2COO- E-咪唑基- CH2COO-+ HI,（5）吲哚基的化學(xué)修飾 4-硝基苯硫氯反應(yīng)： E-吲哚基+CIS-苯環(huán)-NO2 E-吲哚基-S-苯環(huán)-NO2+HCL （6）二硫鍵的化學(xué)修飾 2-巰基乙醇修飾： S E + SH-CH2-CH2OHSH-E-S-S- CH2-CH2OH S,酶

14、蛋白側(cè)鏈經(jīng)修飾后，可以穩(wěn)定酶分子的催化活性，提高抗變性的能力。 如超氧化物歧化酶(SOD)，作為藥物在體內(nèi)的半衰期僅為610min，影響其藥用效果。 用聚乙二醇、右旋糖酐、聚蔗糖分別對SOD分子上的Lys的-NH2進(jìn)行修飾后，所得到的修飾酶在血液中的半衰期可從原來的6-10min增加到幾小時(shí)，甚至達(dá)35h；,應(yīng)用某些雙功能交聯(lián)劑如戊二醛、聚乙二醇等可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。 如：用聚乙二醇修飾后的過氧化氫酶，抗蛋白水解酶的能力有明顯增加而且抗原性消失。,2、酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián),對于依賴輔因子的酶，可將輔因子共價(jià)結(jié)合在酶上或引入新的或修飾過的具有強(qiáng)反應(yīng)性

15、的輔因子； 如：對于金屬酶中的金屬離子可以采取置換的辦法來改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。 如羧肽酶A的活性部位中的鋅被鈷取代后，原有的酯酶活力和肽酶活力都增加；在淀粉酶中用鈣取代其他金屬離子也能使酶的穩(wěn)定性提高。,3、修飾酶的輔因子,酶與某些蛋白質(zhì)、多糖等高分子化合物結(jié)合后，可以增加其穩(wěn)定性。 如-淀粉酶在65時(shí)的半衰期僅為25 min，用右旋糖酐修飾后，其半衰期可增加到63min。,4、酶與大分子化合物相結(jié)合,肽鏈的一部分水解后有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位。 如用胰蛋白酶對天冬氨酸酶進(jìn)行有限水解切去10個(gè)氨基酸后，酶的活力提高了5.5倍。說明天然酶并不總是處于最佳構(gòu)象狀

16、態(tài)。,5、肽鏈的有限水解,酶分子經(jīng)過化學(xué)修飾后，其特性在一定程度上發(fā)生改變，天然酶的一些不足之處可以得到改善。,六、修飾酶的特性,1、熱穩(wěn)定性提高,原因1 :修飾劑共價(jià)連接于酶分子后，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生一定的“剛性”，不易伸展失活，并減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動，從而增加了熱穩(wěn)定性。這種熱穩(wěn)定性效果和修飾劑與酶之間的交聯(lián)點(diǎn)的數(shù)目有關(guān)。（PEG和酶以單點(diǎn)交聯(lián)時(shí)熱穩(wěn)定性提高并不明顯，通常交聯(lián)點(diǎn)增多，酶的熱穩(wěn)定性就可提高）,原因2:修飾劑本身增加了酶分子的表面親水性，使酶分子在水溶液中形成新的氫鍵和鹽橋。 如-胰凝乳蛋白酶的表面氨基經(jīng)乙醛酸修飾，再還原成親水性更強(qiáng)的-NHCH2COOH后，在60時(shí)熱

17、穩(wěn)定性提高了1000倍，這種穩(wěn)定的酶可用于醫(yī)藥和洗滌工業(yè)。,2、抗各類失活因子能力提高 某些酶修飾后抗蛋白水解酶水解、抗抑制劑、抗酸、堿、有機(jī)溶劑等變性失活能力明顯提高。 原因1：修飾劑所產(chǎn)生的空間屏蔽有效地阻擋了水解酶、抑制劑等失活因子的進(jìn)攻； 原因2:酶分子中對蛋白水解酶等失活因子敏感的基團(tuán)被修飾，因此使得某些修飾酶的抗失活因子能力提高。,如:過氧化氫酶經(jīng)PEG修飾后，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明顯提高； 尿激酶經(jīng)白蛋白修飾后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盤抑制劑能力也分別增加。,原因：酶分子結(jié)構(gòu)上有一些氨基酸殘基組成了抗原決定簇，當(dāng)酶作為異源蛋白進(jìn)入機(jī)體后，就會誘發(fā)產(chǎn)生抗體，使酶失活；而化

18、學(xué)修飾后，有些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成了共價(jià)鍵，可能破壞了酶分子上抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，降低抗原性。同時(shí)大分子修飾劑也同樣能“遮蓋”抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。 如：-葡萄糖苷酶用白蛋白修飾后抗原性消除；L-天門冬酰胺酶用PEG修飾后也消除了抗原性。而糖類物質(zhì)包括右旋糖酐也不容易消除酶的抗原性。PEG、人血清白蛋白、聚丙氨酸在消除或降低酶抗原性上效果明顯。,3、抗原性消除,4、體內(nèi)半衰期延長,許多酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，由于增強(qiáng)了抗蛋白水解酶、抗抑制劑等失活因子的能力和熱穩(wěn)定性的提高，體內(nèi)半衰期比天然酶延長，這對提高藥用酶的療效很有意義。 L-天門冬酰胺酶經(jīng)PEG修飾后，體內(nèi)半衰期延長13倍；白蛋白修飾的-葡萄糖苷酶在體內(nèi)的半衰期延長18倍以上。,5、最適pH改變,有些酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生變化，這在生理和臨床應(yīng)用上以及工業(yè)生產(chǎn)中更好地發(fā)揮酶的催化作用具有重要意義。,6、酶學(xué)性質(zhì)變化,絕大多數(shù)酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，最大反應(yīng)速度Vm沒有變化。但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)Km值會增大。,化學(xué)修飾還可改變某些酶的底物專一性。 如:脂肪酶經(jīng)過PEG修飾后，就可溶于有機(jī)